骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肺移植后急性肺損傷的影響

朱國(guó)松 王廣治 王開(kāi)偉

河南省人民醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科（鄭州450000）

肺移植（lung transplantation）是治療終末期肺疾病的唯一有效手段，但患者術(shù)后的生存率持續(xù)較低［1］。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是導(dǎo)致肺移植后患者死亡的重要原因之一［2］。目前，肺移植后急性肺損傷的防治主要從保護(hù)線(xiàn)粒體功能、抑制還原型輔酶Ⅱ（DADPH）氧化酶活性、氣體治療、表面活性劑、前列腺素以及高壓氧療法等方面進(jìn)行，但并未取得令人振奮的療效［3-4］。目前臨床上急需治療肺移植后ALI的積極有效的措施。盡管骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肺移植后ALI還未見(jiàn)報(bào)道，但是已有研究證實(shí)，骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞能夠引起機(jī)體中抑炎因子IL?10和TGF?β水平的升高，并增加體內(nèi)調(diào)節(jié)型T細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞的比例，從而降低炎性反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡［5］。骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞增多時(shí)，肺組織損傷明顯減輕，肺泡細(xì)胞凋亡減少，肺泡上皮細(xì)胞損傷減輕，肺功能得到明顯改善［6］。本研究擬評(píng)價(jià)骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肺移植后急性肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠骨髓Sca-1 間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定選擇2周齡體質(zhì)量30 ～40 g雄性SD大鼠，拉頸處死后無(wú)菌取脛骨和股骨，剪開(kāi)兩端骨骺，用PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖液）通過(guò)7號(hào)針頭沖洗骨髓腔取大鼠骨髓。用Sca?1+磁性分選試劑盒（Stem Cell公司）無(wú)菌條件下分選得到Sca?1+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），培養(yǎng)于大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)至第3代（P3），應(yīng)用PBS緩沖液稀釋成2×106/mL細(xì)胞，鑒定后備用。

1.2 建立大鼠自體左肺原位移植模型為了既能排除免疫排斥反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，又能模擬臨床肺移植過(guò)程，本研究采用了大鼠自體左肺原位移植模型。參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］并結(jié)合本研究特點(diǎn)，將大鼠麻醉后右側(cè)臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，氣管切開(kāi)插管連接微型動(dòng)物呼吸機(jī)（型號(hào)HX?300，成都泰盟科技有限公司）輔助呼吸，輔助呼吸參數(shù)為：呼吸頻率（RR）75次/min，潮氣量10 mL/kg，吸入氧濃度（FiO2）1.0。經(jīng)左側(cè)第五肋間隙切口進(jìn)胸腔并打開(kāi)縱膈，靜脈注射肝素鈉（375 U/kg），游離肺門(mén)處的左肺動(dòng)脈、靜脈和氣管。無(wú)損傷夾分別夾畢左肺動(dòng)脈、靜脈和氣管，此時(shí)潮氣量呼吸頻率（RR）100次/min，潮氣量8 mL/kg。左肺灌注器官保護(hù)液，然后把套有塑料袋的左肺上提至切口平面（勿與心臟接觸），加入冷生理鹽水使袋內(nèi)溫度維持在4 ℃左右。1 h后，去除塑料袋，左肺復(fù)溫30 min后模擬臨床肺移植過(guò)程，開(kāi)放左肺氣管、動(dòng)脈和靜脈。逐層縫合關(guān)閉胸腔，最終獲得模擬臨床肺移植全過(guò)程的大鼠自體左肺原位移植模型。

1.3 分組試驗(yàn)動(dòng)物分為3組：成年SD大鼠24只，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量250 ～300 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組。C組：空白對(duì)照組（n = 8只），不做任何處理，僅做空白對(duì)照；M組（n = 8只）：模型組，SD大鼠行自體左肺原位移植術(shù)，術(shù)后立即經(jīng)尾靜脈注射PBS緩沖液，共0.5 mL；B組（n = 8只）：模型+骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞，SD大鼠行自體左肺原位移植術(shù)后，經(jīng)尾靜脈注射骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞2 × 106/mL，共0.5 mL。術(shù)后48 h處死所有大鼠，取肺部組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 病理學(xué)檢查取左肺上葉，于10%多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片HE染色，中性樹(shù)脂封片，在光鏡下觀察肺病理學(xué)改變。

1.5 血?dú)夥治龃笫舐樽砗蠹糸_(kāi)胸腔，暴露心臟，動(dòng)脈血?dú)忉槾┐套笮氖胰⊙捎脛?dòng)脈血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.6 肺含水率取左肺下葉，用濾紙擦去肺組織的水分，稱(chēng)重記為濕重。然后置于80 ℃烤箱內(nèi)，烘烤24 h后稱(chēng)重記為干重，肺含水率（%）=（濕重?干重）/濕重×100%。肺組織中H2O2、MDA、IL?6以及TNF?α檢測(cè)肺組織組織勻漿后，分別采用H2O2、MDA、IL?6以及TNF?α測(cè)試劑盒（南京凱基公司）檢測(cè)肺組織中H2O2、MDA、IL?6以及TNF?α濃度。

1.7 Western blot 方法檢測(cè)肺組織SPB和CC10表達(dá)水平加液氮在研缽中將肺組織研磨至混懸液提取蛋白。蛋白定量后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗小鼠抗SPB（批號(hào)sc?53137，稀釋度1∶200，Santa Cruz公司，美國(guó)），一抗小鼠抗CC10（批號(hào)sc?390313，稀釋度1∶200，Santa Cruz公司，美國(guó)）和小鼠抗β?actin（稀釋度1∶2 000，武漢三贏生物技術(shù)有限公司）4 ℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（稀釋度1∶2 000，武漢三贏生物技術(shù)有限公司），37 ℃孵育120 min，按照ECL發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）操作步驟暗室曝光、顯影、定影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)結(jié)果與C組比較，M組肺組織鏡下見(jiàn)肺泡腔內(nèi)滲出增多，肺泡腔狹窄，肺間質(zhì)明顯出血充血，肺泡間隔增厚，細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺實(shí)質(zhì)所占的比例增加。與M組比較，B組肺組織鏡下見(jiàn)輕度的病理改變，有少量的滲出物，肺間質(zhì)出血充血減少，少量的細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔輕微增厚，見(jiàn)圖1。

圖1 3 組大鼠肺組織切片HE 染色后，在光鏡下肺病理學(xué)改變（×100）Fig.1 Histopathological changes of lung in 3 groups of rats after HE staining（×100）

2.2 肺功能相關(guān)指標(biāo)與C組比較，M組大鼠動(dòng)脈血中氧分壓（PaO2）降低，肺含水率和二氧化碳分壓（PaCO2）升高（P ＜0.05）；與M組比較，B組大鼠動(dòng)脈血中氧分壓升高，肺含水率降低（P ＜0.05），二氧化碳分壓改善不明顯，見(jiàn)表1。

表1 3 組大鼠肺組織含水率和動(dòng)脈血中PaO2、PaCO2指標(biāo)Tab.1 Changes of lung water content and arterial blood PaO2、PaCO2 in 3 groups of rats ±s

表1 3 組大鼠肺組織含水率和動(dòng)脈血中PaO2、PaCO2指標(biāo)Tab.1 Changes of lung water content and arterial blood PaO2、PaCO2 in 3 groups of rats ±s

注：與C 組比較，aP ＜0.05；與M 組比較，bP ＜0.05

指標(biāo)PaO2（mmHg）PaCO2（mmHg）肺含水率（%）C 組72.79±5.81 40.10±4.41 67.47±4.99 M 組62.25±5.31a 46.16±7.03a 81.57±5.36a B 組67.80±5.77b 43.76±3.88 75.91±3.69ab

2.3 氧化因子和炎癥因子檢測(cè)結(jié)果與C組比較，M組大鼠肺組織中過(guò)氧化物丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2），和炎癥因子白介素?6（IL?6）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）濃度顯著升高；與M組比較，B組大鼠肺組織中過(guò)氧化物丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2），和炎癥因子白介素?6（IL?6）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）濃度降低，見(jiàn)表2。

表2 3 組大鼠肺組織中H2O2、MDA、IL?6 和TNF?α指標(biāo)Tab.2 Changes of H2O2、MDA、IL?6 and TNF?α in 3 groups of rats ±s

表2 3 組大鼠肺組織中H2O2、MDA、IL?6 和TNF?α指標(biāo)Tab.2 Changes of H2O2、MDA、IL?6 and TNF?α in 3 groups of rats ±s

注：與C 組比較，aP ＜0.05；與M 組比較，bP ＜0.05

組0.78ab 0.81ab 7.01b 5.30ab

2.4 標(biāo)志物SPB 和CC10 的表達(dá)水平與C組比較，M組大鼠肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志物SPB和氣道黏膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物CC10的表達(dá)下調(diào)（P ＜0.05）；與M組比較，B組大鼠肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志物SPB和氣道黏膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物CC10的表達(dá)上調(diào)（P ＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 3 組大鼠肺組織中SPB 和CC10 指標(biāo)Fig.2 Changes of SPB and CC10 in 3 groups of rats

3 討論

SPB和CC10分別是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物，主要反應(yīng)肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞的數(shù)量和功能［9-10］。本研究結(jié)果表明，與C組比較，M組大鼠肺組織充血、出血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，PaO2下降；炎癥因子IL?6、TNF?α和氧化因子H2O2、MDA水平升高；Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物SPB和CC10表達(dá)下調(diào)。這提示肺移植不僅導(dǎo)致大鼠肺組織充血、出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、PaO2下降；還可引起肺組織中炎癥反應(yīng)和氧化損傷，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞受損，進(jìn)而誘發(fā)肺移植后急性肺損傷。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）被稱(chēng)為組織重建的“種子細(xì)胞”，許多組織或器官的缺損或病變均可以通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療［11］。BMSCs除了具有多向分化潛能，還能在損傷部位反應(yīng)性地分泌各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)因子，這些因子不僅參與炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)，也參與了修復(fù)損傷的組織器官［12-13］。有學(xué)者研究［14-15］發(fā)現(xiàn)BMSCs可通過(guò)降低活性氧簇水平，提高機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的活性，并減少炎癥因子的釋放，對(duì)脊髓損傷具有保護(hù)作用。Sca?1蛋白對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)起到不可忽視的作用［16］。骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)具備BMSCs和Sca?1雙重優(yōu)勢(shì)。在本研究中，B組大鼠肺移植后給予骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞處理，與M組比較，B組大鼠肺組織有少量的充血、出血，肺水腫減輕，PaO2升高；炎癥因子IL?6、TNF?α和氧化因子H2O2、MDA水平下降；Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物SPB和CC10表達(dá)上調(diào)。這提示骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞可減輕肺移植后的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，修復(fù)受損的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞，提高氧分壓，減輕肺水腫，改善肺功能。具體機(jī)制可能是：骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至受損的肺組織，不僅可以改善局部?jī)?nèi)環(huán)境，而且可以定向分化為新的肺泡上皮細(xì)胞和氣道黏膜上皮細(xì)胞，進(jìn)而改善肺功能；骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞具備分泌抑炎因子的能力，這些因子參與了炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)，減輕了肺組織的炎癥和氧化損傷；骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子，這些營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)受損的肺部細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)，幫助其維持和恢復(fù)正常的功能。

通過(guò)研究骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)肺移植ALI的治療作用及相關(guān)機(jī)制，有望為臨床上治療肺移植ALI患者提供有效、可行的治療策略。但是，本研究?jī)H收集肺移植成功后48 h的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，存在一定的缺陷和不足，而骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肺移植的遠(yuǎn)期生存和預(yù)后有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，骨髓Sca?1間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過(guò)減輕炎癥及氧化損傷，以及修復(fù)受損的肺泡及氣道黏膜上皮細(xì)胞等途徑減輕肺移植后急性肺損傷。