淫羊藿次苷Ⅱ對舌鱗狀細胞癌上皮?間質轉化的抑制作用

莫志洋 李英 韓曉東 王虹霞 翁巧鳳

青海省人民醫院1頜面整形外科，2麻醉科（西寧810008）；3青海大學附屬醫學院口腔科（西寧810001）

舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是常見的口腔惡性腫瘤，發病率、病死率均較高［1-2］。上皮?間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉移、侵襲的起始步驟，與口腔鱗癌、喉癌、乳腺癌等惡性腫瘤發展過程密切相關［3-5］。淫羊藿次苷Ⅱ（icariside Ⅱ，ICSⅡ）是中藥淫羊藿主要提取物，可增強免疫功能、延緩衰老、調節骨代謝，抗腫瘤作用顯著。目前，臨床對ICS Ⅱ的探索多圍繞骨髓間充質干細胞成骨性分化、腫瘤細胞增殖等方面［6-7］，鮮有關于其對TSCC EMT作用的研究。近年來有研究表明［8-9］，Notch1/PTEN/FAK信號傳導途徑的異常激活是腫瘤形成機制之一，且參與調節多種組織細胞的生長、分化、凋亡，但關于該通路在TCSS EMT中的作用研究尚少。鑒于此，本研究將探討ICSⅡ對TSCC細胞EMT影響，并探究其通過Notch1/PTEN/FAK通路的調控機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞TSCC細胞Tca?8113，購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑、主要儀器淫羊藿次苷Ⅱ（上海純優生物科技有限公司，純度＞98%），胎牛血清、RPMI?1640培養基（美國Amresco公司），四氮唑鹽（microculture tetrozolium，MTT）溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司），吉姆薩（Giemsa）染色液（南京億迅生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（日本Takara公司），兔抗人Notch1、PTEN、FAK、磷酸化FAK（p?FAK）單抗（美國Abcam公司），辣根過氧化酶標記的二抗（上海合星生物科技有限公司）。

NIB900?FL型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），SpectraMax iD3酶聯免疫檢測儀（美谷分子儀器（上海）有限公司），Transwell小室（北京優尼康生物科技有限公司），TY?80電泳儀（南京普陽科學儀器研究所），Fluor Chem FC2凝膠成像系統（美國Bio?rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、干預RPMI?1640培養基（含10%胎牛血清），37 ℃、5 % CO2培養箱常規培養Tca?8113細胞，隔天換液，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，待貼壁80%左右，胰酶消化調整密度傳代。取對數期細胞分裝至96孔板，200 μL/孔，設為空白組，ICS Ⅱ低、中、高劑量組，每組5個復孔，至細胞再次貼壁80%左右，加入不同濃度ICS Ⅱ，使各孔終濃度分別為12.5、25、50 μmol/L，空白組加入等量PBS處理，繼續常規條件培養。

1.2.2 細胞增殖抑制率測算MTT法：取各組干預24、48、72 h的Tca?8113細胞，棄去舊培養基后將新制備MTT溶液（濃度為5 μg/μL）滴入每孔中，20 μL/孔，于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養4 h，棄去上層培養液，每孔加入DMSO溶液，100 μL/孔，充分震蕩30 min后采用酶聯免疫檢測儀測定570 nm處吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率（%）=（A空白組?A劑量組）/A空白組×100%。重復3次取均值。

1.2.3 細胞遷移能力測定劃痕試驗：取各組干預48 h的Tca?8113細胞，胰酶消化，重懸，重新調整密度至2.0 × 104個/mL，接種于6孔板，孵育24 h待細胞鋪滿后棄去培養基。采用2 μL移液器槍頭沿單層細胞劃過，PBS輕吹去除細胞碎片，置入完全培養基繼續孵育24 h后。采用顯微鏡觀察，計算細胞遷移率（%）=（初始劃痕寬度—測量時劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.4 細胞侵襲能力測定Transwell小室試驗：取各組干預48 h的Tca?8113細胞，調整細胞密度為2.0 × 105個/mL的細胞懸液，取200 μL接種于Transwell小室（24孔趨化板，孔徑8 μm）上室，下室中加入含10%胎牛血清培養基，孵育24 h擦去上室細胞，采用預冷PBS溶液沖洗，10%甲醛固定15 min，Giemsa染色后取少量懸液置于計數板中，顯微鏡觀察穿膜細胞數量。

1.2.5 細胞中Notch1、PTEN、FAK、p-FAK 蛋白相對表達量Western blot法：取各組干預72 h的TSCC細胞，冰上裂解，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為8 cm），BCA試劑盒定量蛋白。取30 μg樣品與上樣緩沖液混合，凝膠電泳30 min，電轉45 min，加入5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）于4 ℃孵育過夜，TBTS沖洗，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶10 000），常溫孵育2 h，TBTS沖洗。20 min內曝光、顯影。采用凝膠成像系統掃描，以Notch1、PTEN、FAK、p?FAK蛋白灰度值/內參β?actin灰度值表示蛋白相對表達量，計算p?FAK/FAK。

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0統計學軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，多樣本計量資料以方差分析檢驗，以SNK?q檢驗分析兩兩樣本。P ＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組增殖抑制率增殖抑制率組間比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；ICS Ⅱ低、中、高劑量組24、48、72 h增殖抑制率均呈上升趨勢（P ＜0.05）；隨時間延長各組增殖抑制率呈上升趨勢（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate in each group ±s，%

表1 各組增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate in each group ±s，%

注：與ICS Ⅱ低劑量組比較，aP ＜0.05；與ICS Ⅱ中劑量組比較，bP ＜0.05；與24 h 比較，cP ＜0.05；與48 h 比較，dP ＜0.05

組別ICSⅡ低劑量組ICSⅡ中劑量組ICSⅡ高劑量組F 值P 值24 h 17.45±2.17 20.35±3.84a 24.91±3.97ab 6.024 0.015 48 h 21.30±3.87c 26.02±3.95ac 31.63±4.01abc 8.597 0.005 72 h 27.61±3.90cd 32.76±4.29acd 38.71±5.01abcd 7.883 0.007

2.2 各組遷移能力空白組，ICSⅡ低、中、高劑量組遷移率分別為（86.14±9.11）%、（72.62±7.45）%、（60.91 ± 8.14）%、（33.86 ± 5.16）%，遷移率組間比較，差異有統計學意義（F=42.669，P ＜0.001）；空白組大于ICSⅡ低、中、高劑量組（t=2.569，P=0.033；t = 4.618，P = 0.002；t = 11.166，P ＜0.001）；ICSⅡ低劑量組大于ICSⅡ中、高劑量組（t = 2.373，P =0.045；t = 9.564，P ＜0.001），ICSⅡ中劑量組大于ICSⅡ高劑量組（t=6.276，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 劃痕試驗結果（×100）Fig.1 Scratch test results（×100）

2.3 各組侵襲能力空白組，ICS Ⅱ低、中、高劑量組每個視野穿膜細胞數分別為（119.86 ± 27.09）、（98.74±18.92）、（40.30±7.35）、（19.10±4.27）個，穿膜細胞數組間比較，差異有統計學意義（F = 38.851，P ＜0.001）；空白組多于ICS Ⅱ低、中、高劑量組（t=2.469，P=0.039；t=6.338，P ＜0.001；t=8.216，

P ＜0.001）；ICS Ⅱ低劑量組多于ICS Ⅱ中、高劑量組（t=6.438，P ＜0.001；t=9.181，P ＜0.001），ICS Ⅱ中劑量組多于ICS Ⅱ高劑量組（t=5.577，P=0.001）。見圖2。

圖2 Transwell 小室試驗結果（×100）Fig.2 Transwell chamber test results（×100）

2.4 各組Notch1、PTEN蛋白相對表達量及p-FAK/FAKNotch1、PTEN蛋白相對表達量及p?FAK/FAK比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；空白組，ICS Ⅱ低、中、高劑量組Notch1蛋白相對表達量及p?FAK/FAK呈降低趨勢（P ＜0.05），PTEN蛋白相對表達量呈升高趨勢（P ＜0.05）。見表2、圖3。

3 討論

TSCC是起源于舌復層鱗狀上皮的頭頸部惡性腫瘤，惡性程度高、浸潤性強，病灶可浸潤口腔頜面部、頸部重要組織結構，導致血管破裂、疼痛、張口受限等［10］。目前手術切除、放療、化療等綜合療法治療TSCC可獲取一定效果，但遠期生存率并不理想［11］。研究［12］認為，腫瘤遠處轉移及局部侵襲是其惡性特征的主要表現，且是導致TSCC預后不良的重要因素，而EMT是該過程中的重要環節。因此，抑制EMT是改善TSCC預后、延長其生存期限的關鍵。近年來，隨著對傳統中藥開發、應用力度的逐漸加大，從天然植物中提取化合物治療腫瘤已成為臨床研究熱點。淫羊藿是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，具有促進精液分泌、降壓、降糖、利尿、抗腫瘤、抗衰老及增強造血功能和免疫功能等功效［13］。ICSⅡ提取自淫羊藿，其抗腫瘤作用近年來備受關注。

表2 各組Notch1、PTEN 蛋白相對表達量及p?FAK/FAKTab.2 Comparison of relative expression of Notch1 and PTEN protein and p?FAK/FAK in each group ±s

表2 各組Notch1、PTEN 蛋白相對表達量及p?FAK/FAKTab.2 Comparison of relative expression of Notch1 and PTEN protein and p?FAK/FAK in each group ±s

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與ICS Ⅱ低劑量組比較，bP ＜0.05；與ICS Ⅱ中劑量組比較，cP ＜0.05

組別空白組ICSⅡ低劑量組ICSⅡ中劑量組ICSⅡ高劑量組F 值P 值Notch1 0.85±0.08 0.69±0.07a 0.44±0.04ab 0.21±0.02abc 118.935＜0.001 PTEN 0.22±0.03 0.41±0.05a 0.68±0.07ab 0.80±0.08abc 93.367＜0.001 p?FAK/FAK 0.84±0.09 0.58±0.06a 0.37±0.04ab 0.15±0.02abc 126.764＜0.001

圖3 蛋白免疫印記圖Fig.3 Immuno?imprint of protein

本研究結果顯示，ICSⅡ低、中、高劑量組增殖抑制率依次升高；空白組、ICSⅡ低、中、高劑量組遷移率依次降低，每個視野穿膜細胞數依次減少，提示ICS Ⅱ可抑制TSCC細胞增殖，降低其遷移、侵襲能力，且呈劑量依賴。ICS Ⅱ屬淫羊藿黃酮苷類化合物，可抑制骨質疏松、保護神經系統，且在宮頸癌、肝癌中均表現出良好的抗腫瘤作用［14-15］。NI等［16］采用菌落形成、Transwell小室試驗及遷移測定等方式發現，ICSⅡ可通過影響細胞內能量代謝，誘導癌細胞凋亡，降低其遷移、侵襲能力，與本研究結論相似，但本研究采用不同劑量ICSⅡ進行研究，更具說服力。SONG等［17］在探究ICS?Ⅱ對A549、H1299細胞遷移能力的影響中發現，ICS?Ⅱ可抑制由炎癥因子誘導的EMT及癌細胞侵襲。本研究采用ICSⅡ干預TSCC細胞后，細胞增殖受到抑制，且遷移、侵襲能力降低，可能與其抑制該腫瘤EMT程序信號、調控相關基因表達有關。

此外，本研究中，ICSⅡ低、中、高劑量組Notch1蛋白及p?FAK/FAK呈降低趨勢，PTEN蛋白呈升高趨勢，推測ICSⅡ可能通過調控Notch1/PTEN/FAK信號通路，抑制TSCC細胞EMT，且呈劑量依賴性。Notch1通路是廣泛參與細胞分化、發育、調控的重要信號途徑，在不同腫瘤中發揮促癌或抑癌作用，甚至在同一腫瘤的不同階段可發揮相反的生理作用［18-19］。LIU等［20］認為，Notch1基因在TSCC中異常高表達，采用Notch通路抑制劑DAPT可抑制TSCC細胞侵襲及轉移。PTEN是最早發現的具有蛋白磷酸酶、脂質磷酸酶雙重活性的抑癌基因，可通過多條通路調控腫瘤生物學行為［21］。Notch1基因可能通過負性調控PTEN參與TSCC疾病進程。FAK是位于胞質的酪氨酸蛋白激酶，可通過促使細胞增殖從而激發細胞侵襲性生長。PTEN可通過降低FAK酪氨酸磷酸化水平，減少肌動蛋白纖維數量、減弱細胞運動能力，抑制腫瘤黏附性生長，從而抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲［22］。本研究應用不同濃度ICSⅡ干預TSCC細胞，可能通過抑制Notch1表達及FAK磷酸化，上調PTEN而影響腫瘤細胞生長，降低其遷移、侵襲能力。

綜上所述，ICSⅡ可抑制TSCC細胞增殖、遷移、侵襲能力，且呈明顯劑量依賴性，推測其可能通過下調Notch1表達、上調PTEN表達、抑制FAK磷酸化發揮抗TSCC作用。基于ICSⅡ、Notch1/PTEN/FAK通路在TSCC治療中的作用，不僅為TSCC藥物的研發提供了更多的方向與思路，還為ICSⅡ應用于TSCC的控制提供了更多理論依據。然而，ICSⅡ對Notch1/PTEN/FAK信號傳導途徑下游信號分子的影響如何，以及作用于TSCC時是否存在其他調控機制尚未明確，這也將是下一步的研究方向。