虎杖苷對實驗性哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其機制

樸玉華, 王知廣, 樸藝花, 姜京植, 王重陽, 徐 暢, 李良昌, 延光海, 樸紅梅

（1.延邊大學附屬醫院呼吸內科，吉林 延吉133002；2.延邊大學醫學院解剖學教研室吉林省過敏性疾病重點實驗室，吉林 延吉 133002）

哮喘為慢性氣道炎癥性疾病，其中Th1 / Th2細胞因子的表達失衡在哮喘發病機制中發揮重要作用。 Th2 細胞因子白細胞介素4 （interleukin-4，IL-4）、白細胞介素5 （interleukin-5，IL-5） 和白細胞介素13 （interleukin-13， IL-13） 參與哮喘炎癥反應，并介導免疫球蛋白E （IgE） 的產生，引起血液和肺組織中嗜酸性粒細胞的聚集，導致黏液分泌增多和氣道高反應性以及氣道重塑等［1］。目前減輕炎癥反應仍然是治療哮喘的有效方法。沉默信息調 節 因 子 1 （silent information regulator of transcription 1，SIRT1） 也稱為NAD+依賴性脫乙酰基酶sirtuin-1， 是sirtuin 蛋白家族成員之一。SIRT1 已被證實能介導多種細胞事件， 對炎癥、衰老和抗腫瘤等多方面有一定調控作用［2］。核因子κB （nuclear factor-kappaB， NF-κB） 是炎癥反應中重要的調節靶點，可被典型和非典型信號通路激活。過敏原和促炎細胞因子等可以激活NF-κB，并加重哮喘的炎癥反應［3］。研究［4-5］證明：SIRT1可以調節哮喘中炎癥因子的表達， 并通過調控NF- κB 乙酰化水平介導炎癥的發生發展。 因此，SIRT1 可能是參與哮喘炎癥調控的重要靶點。

虎杖苷（polydatin， PD） 是植物虎杖的提取物，是一味天然創新藥物，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤、抗凋亡和氧化應激等，并且參與炎癥相關的全身組織器質性疾病，如肺惡性腫瘤、急性腎損傷及化膿性腦膜炎等疾病的發生發展［6-8］。研究［9］顯示：PD 能夠上 調SIRT 1 蛋白的表達，增加巨噬細胞增殖，降低氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL） 誘導的細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平， 抑 制 炎 癥 細 胞 因 子 的 表 達。 YE 等［10］發 現：PD 可以直接抑制lyn 和syk 激酶活性，下調絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 和NF-κB 信號通路，抑制肥大細胞脫顆粒，從而減輕哮喘氣道炎癥。目前尚無PD 在哮喘模型中對SIRT 1／NF-κB 通路影響的研究報道。本研究探討PD 對卵清蛋白（ovalbumin， OVA） 誘導哮喘模型的治療作用及其對SIRT 1／NF-κB 通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物50 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠，清潔級， 購自延邊大學實驗動物中心， 體質量（20 ±2） g， 動物生產許可證號： SCXK （吉）2017-0003。本研究獲得延邊大學醫學院倫理委員會的批準，所有實驗環節嚴格遵照《實驗動物管理條例》 進行操作。

1.2藥物、主要試劑和儀器PD 購自上海純優生物有限公司。 OVA 、 Al （ OH）3粉和乙酰化NF- κB p65 （3045S） 購 自 美 國Cell Signaling Technology 公 司， SIRT1 抗 體（TA336801） 和β -actin 抗體（TA-09） 購自北京中杉金橋公司，免疫組織化學試劑盒、DAB 試劑盒、IL-4、IL-5 和IL- 13 ELISA 試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。2135 型輪轉式切片機購自德國徠卡公司，霧化吸入器購自大連醫療器械廠U- 219，Western blotting轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司， 酶聯免疫檢測儀（ 型 號RT-2100C） 購 自 美 國RAY- TO 公 司，5415D 型低溫高速多功能離心機購自美國Eppendorf 公司，Amersham Imager 6 00 凝膠成像儀購自美國GE Healthcare 公司。

1.3動物分組和模型制備50 只雌性BALB/c 小鼠隨機分為對照組，OVA 模型組，低、中和高劑量PD 組（PD 劑量為15、30 和45 mg·kg－1）；每組10 只。所有小鼠適應性飼養1 周，于飼養第1、7和14 天對照組小鼠腹腔注射0.2 mL 生理鹽水，其余4 組小鼠采 用0.2 mL 混合 液［10 μ g OVA 和1 mg Al （ OH）3］ 腹腔注射致敏。 第21 天起，低、中和高劑量PD 組小鼠分別腹腔注射15、30 和45 mg·kg－1PD 治 療 液0.2 mL ， 每 天1 次， 連 續7 d，對照組和OVA 組小鼠以0.2 mL 生理鹽水代替（激發前1 h 給藥）。 第21 天起給藥1 h 后，OVA 組和各劑量PD 組小鼠連續采用激發液（含3% OVA 10 mL） 霧化激發7 d，每次30 min，對照組小鼠采用生理鹽水代替。在激發過程中模型組小鼠出現煩躁、打噴嚏、撓腮和呼吸急促等表現，視為造模成功。

1.4標本采集最后一次致敏24 h 后麻醉小鼠，并固定于手術板上，縱行切開頸部皮膚，逐層剝離暴露氣管，氣管切一小口插入細管，緩慢注入4 ℃生理鹽水1 mL后回抽3次，回抽量不得少于0.8 mL。收集的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF） 以3 000 r·min－1離心5 min。收集上清液置于－80 °C 凍存，采用離心后的沉淀物制作涂片。最后取出小鼠左肺組織置于甲醛溶液中固定，右肺組織置于－80°C 條件下保存。

1.5各組小鼠肺組織形態表現檢測各組小鼠左肺組織置于甲醛溶液中固定后，按濃度梯度依次進行脫水、浸蠟包埋等過程， 并將蠟塊切成厚度為4 μm 的切片，分次進行HE 和PAS 染色。鏡下觀察各組小鼠肺組織形態表現。

1.6各組小鼠BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數檢測BALF 沉淀物經離心后加入生理鹽水定容至0.2 mL，混勻后置入細胞涂片離心機離心。Diff-Quick 染色后，在鏡下觀察細胞總數及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數。

1.7各組小 鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平檢測收集小鼠BALF， 按ELISA 試劑盒說明書步驟檢測BALF 中IL-4、 IL-5 和IL-13 水平，單位以ng·L－1表示。

1.8免疫組織化學法檢測各組小鼠肺組織中SIRT1和NF-κB p65蛋白表達肺組織切片經過熔蠟、二甲苯脫蠟和乙醇脫水后，在抗體修復液中孵化15 min。采用SIRT1、NF-κB p65 一抗和對應二抗孵化。 DAB 著色， 蘇木精復染， 脫水和固定、封片，鏡下觀察。

1.9 Western blotting法檢測各組小鼠肺組織中SIRT1和乙酰化NF-κB p65蛋白表達水平提取各組小鼠右肺組織蛋白并檢測蛋白乙酰化水平。 將等 量 蛋 白 （20 μg） 在10% SDS-PAGE 中以70～90 V 電壓進行電泳。然后在300 mA 、4℃條件下轉膜，在脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。分別采用乙酰化NF-κB p65 和SIRT1 抗體4℃孵育過夜。采用TBST 充分洗膜，在對應二抗溶液中常溫搖床孵育1 h。 洗 滌3 次 后， 采 用ECL 試 劑 曝 光， 采 用Amersham Imager 600 軟件分析目的條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/ β-actin 條帶灰度值。

1.10統計學分析采用SPSS 25.0 統計軟件進行統計學分析。各組小鼠BALF 中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數及IL-4、IL-5、IL-13 水平，肺組織中SIRT1 和乙酰化NF-κB p65蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠肺組織形態表現與對照組比較，OVA 組小鼠可見氣管壁增厚，氣道和血管周圍大量炎癥細胞浸潤，各劑量PD 組小鼠經過治療后上述表現得到明顯改善。與對照組比較，OVA 組小鼠可見黏液分泌增多和杯狀細胞明顯增生； 與OVA 組比較，各劑量PD 組小鼠杯狀細胞增生和黏液分泌明顯減少。見圖1 （插頁一）。

2.2各組小鼠BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數OVA 組小鼠BALF 中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數明顯高于對照組（P＜0.05）。與OVA 組比較，中和高劑量PD 組小鼠BALF 中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數明顯減少（P＜0.05），低劑量PD 組小鼠BALF 中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數雖有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠BALF 中炎癥細胞數Fig.2 Number of inflammatory cells in BALF of mice in various groups

2.3各組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平與對照組比較，OVA 組小鼠BALF 中IL-4、IL-5和IL-13 水平明顯升高（P＜0.05）。與OVA 組比較，中和高劑量PD 組小鼠BALF 中IL-4、 IL-5 和IL-13 水 平 降 低（P＜0.05）， 低 劑 量PD 組 小 鼠BALF 中IL-4、 IL-5 和IL-13 水平雖有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4各組小鼠肺組織中SIRT1和NF-kB p65蛋白表達情況與對照組比較，OVA 組小鼠氣道周圍可見棕黃色顆粒狀的SIRT1 和NF-κB p65 聚集較為明顯。與OVA 組比較，各劑量PD 組小鼠氣道周圍SIRT1 的聚集逐漸增多，而NF-κB p65 的聚集逐漸減少。見圖4 （插頁一）。

圖3 各組小鼠BALF 中細胞因子水平Fig.3 Levels of cytokines in BALF of mice in various groups

2.5各組小鼠肺組織中SIRT1和乙酰化NF-κB p65蛋白表達水平OVA 組小鼠肺組織中SIRT1和乙酰化NF-κB p65 蛋白表達水平較對照組明顯升高（P＜0.05）。 與OVA 組比較， 中和高劑量PD 組小鼠肺組織中SIRT1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與OVA 組比較，低劑量PD 組小鼠肺組織中SIRT 1 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與OVA 組比較，中和高劑量PD 組小鼠肺組織中乙酰化NF-κB p65 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與OVA 組比較，低劑量PD 組小鼠肺組織中乙酰化NF-κB p65 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5 和圖6。

3 討 論

哮喘是一個全球性的健康問題，其患病率在全球范圍內逐漸增多，據統計2015 年哮喘患者已達到約3.582 億人，并影響著不同年齡段的人群［11］。氣道炎癥是哮喘的本質特征，通常被認為是由Th2細胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 所介導，并導致杯狀細胞增生、 支氣管收縮和氣道嗜酸性粒細胞增多［12-13］。本研究結果顯示：PD 對哮喘小鼠肺內炎癥細胞滲出、黏液分泌增多和杯狀細胞增生有明顯的抑制作用。同時，PD 能有效抑制小鼠BALF 中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數以及IL-4、IL-5 和IL-13 等促炎因子的表達，表明PD 對OVA 誘導的哮喘小鼠氣道炎癥有一定的抑制作用。

圖5 各組小鼠肺組織中SIRT 1 蛋白表達情況Fig.5 Expressions of SIRT1 protein in lung tissue of mice in various groups

SIRT1 是sirtuin 蛋白質家族的一員，是釀酒酵母sir2 基 因 的 同 源 物。研 究［14］顯 示：SIRT1 參 與代謝相關疾病、自身免疫性疾病、心肌病、神經系統疾病和腫瘤的發生發展。研究［15］顯示：SIRT 1不僅具有抗炎、調節代謝平衡和自噬、抗凋亡和抗氧化應激等功能，而且能夠通過調節組蛋白和轉錄因 子NF- κ B、 缺 氧 誘 導 因 子（hypoxia-inducible factor，HIF） -1α 的去乙酰化抑制炎癥。NF-κB 是炎癥相關的主要調節因子， 由RelA/p65、 c-Rel、RelB、 p50 （NF- κB 1） 和p52 （NF- κB 2） 等5 種蛋白質組成。NF-κB 是參與廣泛炎癥反應中調控細胞因子活性的重要角色，通過其翻譯后修飾調節炎癥，包括RelA / p65 的乙酰化、泛素化和磷酸化等。RelA / p65 的轉錄活性需要Lys310的乙酰化，而SIRT 1 可 以 使Lys310去 乙 酰 化［16-17］。研 究［18］表明：黃連素通過上調SIRT1 的表達，減弱NF-κB p65 的乙酰化，抑制促炎因子的的產生而發揮抗炎特 性。 YU 等［19］研 究 顯 示： 黃 芩 苷 通 過 調 節SIRT1／NF-κ B 通路使促炎細胞因子水平降低，SIRT1 可能是通過抑制NF-κB 活化而發揮調節炎癥的關鍵作用。

圖6 各組小鼠肺組織中NF-κB p65 蛋白表達情況Fig.6 Expressions of NF -κB p65 protein in lung tissue of mice in various groups

PD 是白藜蘆醇的天然前體，是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，而且其具有相似的藥理作用。研究［20］ 顯示：白藜蘆醇作為SIRT1 的激活劑，通過促進RelA / p65 Lys310去乙酰化而抑制NF-κB 的信號傳導。研究［21］證明：PD 通過SIRT／NF-κB 通路抑制燒傷小鼠早期常損傷的炎癥反應。研究［22］表明： PD 能通過增加SIRT1 的表達及下調NF- κB p65 的 移 位、 IκBα 的 降 解 以 及NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白等炎癥組分水平，抑制血清和腎臟中促炎細胞因子的產生，從而起到保護腎功能的作用。本研究結果顯示：PD 能抑制哮喘小鼠氣道炎癥，能促進小鼠肺組織中SIRT1 蛋白表達，抑制NF-κB p65 蛋白表達，降低NF-κB p65 的乙酰化水平。上述實驗結果表明：PD 能抑制哮喘的氣道炎癥反應，且可能通過SIRT／NF-κB 信號通路發揮作用，但具體作用機制需要進一步研究。

綜上所述，PD 能減輕氣道周圍炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生，抑制Th2 細胞相關促炎因子的表達，并促進SIRT1 蛋白及抑制NF-κB p65 表達，從而緩解哮喘小鼠氣道炎癥。因此SIRT1／NF-κB 信號通路可能是PD 抑制哮喘氣道炎癥的作用機制之一。