骨保護素對大鼠正畸牙齒移動過程中破骨細胞分化和p38-MAPK 信號通路的影響

婁 穎, 馬 欣

（河南省人民醫院口腔正畸科，河南 鄭州 450001）

支抗控制為正畸治療是否成功的關鍵，傳統的支抗或多或少存在不足之處，故越來越多的學者嘗試尋找更好的增強支抗的方法，其中金屬基質蛋白酶抑制劑和二磷酸鹽等均有抑制牙齒移動的作用，二磷酸鹽在骨科中應用較為廣泛，但其在骨組織中不容易被代謝，故具有一定局限性。研究［1］顯示：骨保護素在正畸牙齒移動過程中具有較好的控制牙齒移動的作用，但其作用機制不清楚，尚需要做進一步探討。破骨細胞生成和活化在控制牙齒移動過程中發揮重要作用，研究［2-3］顯示：抑制骨保護素的表達可促進破骨細胞生成和分化，提高骨保護素表達可抑制破骨細胞生成和分化，從而抑制牙齒移動。破骨細胞的生成和分化受多種信號通路的調控， p38- 絲裂原活化蛋白激酶（p38-mitogen activated protein kinase， p38-MAPK） 信號通路為調控破骨細胞分化過程的重要信號通路，抑制該通路可抑制破骨細胞分化和局部骨吸收［4］。骨保護素在抑制正畸牙齒移動過程中是否通過p38-MAPK信號通路發揮作用尚不十分清楚。本文作者研究骨保護素對大鼠正畸牙齒移動過程中破骨細胞分化和p38-MAPK 信號通路的影響，探討骨保護素在正畸治療支抗控制中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器128 只3 月齡、健康、清潔級、雄性、SD 大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，體質量280～310 g，動物生產許可證號：SCXK （京） 2014-000。注射用重組人骨保護素（上海科肽生物技術有限公司），多聚甲醛、EDTA 脫鈣液、伊紅和蘇木精（武漢博士德生物工程有限公司）， TRAP 染色試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司）， 兔抗鼠p-p38 單克隆抗體、兔抗鼠核因子κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B， RANK） 單克隆抗體、兔 抗 鼠 基 質 金 屬 蛋 白 酶 9 （matrix metalloproteinase-9， MMP-9） 單克隆抗體（美國Sigma 公司）。正畸用0.25 mm 結扎絲（杭州奧索醫療器械有限公司），正畸用鎳鈦螺旋彈簧（北京圣馬特科技有限公司），正畸測力計（長沙天美醫療器械有限公司），Leica 切片機（上海徠卡儀器有限公司）。

1.2動物分組和處理將128 只大鼠根據隨機數字法分為對照組和骨保護素組，每組64 只。于開始建模前3 d，骨保護素組大鼠于左上頜第一磨牙鄂 側 黏 骨 膜 下 注 射 重 組 人 骨 保 護 素（ 0.05 mg·kg－1）［5］， 對照組大鼠在相同部位注射等量生理鹽水。

1.3正畸牙齒移動大鼠模型的建立將2 組大鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠固定到手術臺上，在上頜左側第一磨牙和第二磨牙的鄰接點穿過結扎絲，結扎絲繞第一磨牙牙頸部1 周，將另一根結扎絲在近中處結扎固定，在第一磨牙近中結扎絲處穿入鎳鈦螺旋彈簧，彈簧另一端穿入結扎絲，力值為50 g。在上頜兩中切牙唇、舌和遠中面緊貼牙齦緣的牙頸部，用裝有金剛砂車針的牙科手機各磨1 個深約0.2 mm 的淺溝。將和彈簧項鏈的結扎絲切入切壓槽溝內，將兩切牙環扎為1 個整體，將彈簧的力值一直保持在50 g。清潔上頜兩中切牙壓面，牙面上涂擦自酸蝕粘結劑，復合樹脂填充材料糊塑，以兩上頜中切牙為支抗，近中移動左側第一磨牙。術后密切觀察大鼠生命體征，燈光保暖。每周加力1 次，彈簧拉力維持在50 g。共4 周。

1.4 2組大鼠第一磨牙移動距離檢測每組取8 只大鼠，分別于加力前和加力后（即加力1、2、3 和4 周時），采用藻酸鹽印模材料在大鼠牙齒加力前后取上頜印模，印模灌注形成石膏模型，修整模型基地，使其和后牙的平面平行，測定加力側（左側） 第一磨牙近中舌溝點和第三磨牙遠中面之間的距離，共3 次，取平均值，加力前后的距離差即為加力側第一磨牙的移動距離。

1.5標本采集分別于加力1、2、3 和4 周時，每組取8 只大鼠，心臟灌注法處死大鼠，手術剪剪下完整左側上頜第一磨牙和其近遠中牙槽骨，去凈周圍軟組織，將組織塊放入甲醛中固定24 h，用于HE 染色和免疫組織化學染色。每組另各取8 只大鼠，水合氯醛麻醉處死大鼠，取大鼠左側上頜第一磨牙近中腭根的冠方牙槽骨（牙槽峭頂至根尖距離的1/2 高度，寬約2 mm），放入EP 管中，置于冰箱中，用于Western blotting 檢測。

1.6標本制作將大鼠上左側頜第一磨牙區牙周組織用生理鹽水沖洗，放入多聚甲醛中固定24 h，加入EDTA 脫鈣液脫鈣6 周，3 d 換液1 次，大頭針刺入無阻力時為脫鈣完全。酒精脫水，二甲苯透明， 石蠟包埋，采用切片機沿牙體長軸切成近遠中向的厚2 μm 的切片，將切片置于烤箱中烤干。

1.7抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色測定2組大鼠牙周組織中破骨細胞數石蠟切片經烤片、脫蠟、 脫水， 每張切片 滴加TRAP 染 色液100 μL，孵育50 min，蒸餾水沖洗，蘇木精溶液復染2 min，堿性自來水沖洗至出現核藍染，自然晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性結果為破骨細胞胞核呈藍色，胞漿呈深紅色或酒紅色；具有3 個或3 個以上胞核的為成熟破骨細胞。400 倍光鏡下觀察染色情況，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算每個高倍視野內破骨細胞數。

1.8免疫組織化學染色檢測2組大鼠壓力側牙周組織中p-p38表達水平石蠟切片經烤片、脫蠟、脫水，蒸餾水沖洗，加入抗原修復液高壓修復3 min，蒸餾水沖洗，加入過氧化氫孵育10 min 滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗，加入一抗：加入兔抗鼠p-p38 單克隆抗體（1∶200） 過夜孵育，陰性對照以PBS 代替一抗，加入聚合物輔助劑孵育15 min，加入二抗孵育30 min，DAB 顯色，自來水沖洗，常規復染、脫水、透明，中性樹膠封片。 采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析大鼠壓力側p-p38 陽性表達情況，并記錄p-p38 的積分光密度（IOD） 值，以IOD 值代表p-p38 表達水平。

1.9 Western blotting法檢測2組大鼠牙周組織中RANK和MMP-9蛋白表達水平取牙槽骨組織塊，液氮下研磨成粉末，加入蛋白裂解液提取牙槽骨總蛋白，采用BCA 法測定牙槽骨蛋白濃度，經常規變性、灌膠、上樣、電泳、轉膜和脫脂奶粉封閉后，加入一抗： 兔抗鼠RANK 單克隆抗體（1 ∶200） 和兔抗鼠 MMP-9 單 克 隆 抗 體（1 ∶300） 過夜孵育，加入二抗（1∶5 000） 孵育1 h， 滴加顯影液顯影， 曝光。 以β-actin 為內參。采用Image Lab software 軟件檢測各蛋白條帶灰度值，計算目標蛋白表達水平。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.10大鼠牙周組織破骨細胞數、RANK和MMP-9蛋白表達水平與p-p38表達水平的相關性分析2 組大鼠牙周組織中破骨細胞數、RANK 和MMP-9 蛋白表達水平與p-p38 表達水平的相關性分析采用Pearson 相關分析法。

1.11統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。2 組大鼠第一磨牙移動距離、牙周組織中破骨細胞數、p-p38 表達水平、RANK和MMP-9蛋白表達水平符合正態分布，以x±s表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組大鼠第一磨牙移動距離對照組和骨保護素組大鼠在加力1、2、3 和4 周時牙齒移動距離均逐漸增加（P＜0.05）。加力1 周時，2 組大鼠牙齒移動距離比較差異無統計學意義（P＞0.05）；加力2、3 和4 周時，骨保護素組大鼠牙齒移動距離小于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 2組大鼠牙周組織中破骨細胞數加力前3 周破骨細胞數逐漸增多，加力3 周時破骨細胞最多，加力4 周時破骨細胞數有所降低。組間比較：加力1 周時，2 組破骨細胞數比較差異無統計學意義（P＞0.05）；加力2、3 和4 周時，骨保護素組大鼠牙周組織中破骨細胞數小于對照組（P＜0.05）。見圖1 （插頁六） 和表2。

表1 2 組大鼠第一磨牙移動距離Tab.1 Movement distance of first molar of rats in two groups (n=8,x±s,l/mm)

表2 2 組大鼠破骨細胞數Tab.2 Number of osteoclasts of rats in two groups（n=8,x±s）

2.3 2組大鼠壓力側牙周組織中p-p38表達水平免疫組織化學染色結果顯示：細胞漿呈黃褐色細胞為p-p38 陽性細胞，一般位于骨吸收陷窩內。加力1 周時， 2 組大鼠破骨細胞中有少量p-p38 陽性表達，隨著時間的增加，破骨細胞中p-p38 陽性表達增加，加力3 周時p-p38 陽性表達最多，且細胞漿和細胞核均染色，加力4 周時p-p38 表達陽性表達有所減少。組間比較：加力1 周時，2 組大鼠壓力側牙周組織中p-p38 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；加力2、3 和4 周時，骨保護素組大鼠壓力側牙周組織中p-p38 表達水平小于對照組（P＜0.05）。見圖2 （插頁六） 和表3。

2.4各組大鼠牙槽骨組織中RANK和MMP-9蛋白表達水平各時間點，骨保護素組大鼠牙槽骨組織中RANK 和MMP-9 蛋白表達水平均低于對照組（P＜0.05）。見圖3 和表4。

表3 2 組大鼠壓力側牙周組織中p-p38 表達水平Tab.3 Expression levels of p-p38 on pressure side of periodontal tissue of rats in various groups （n=8,x±s）

圖3 Western blotting 法檢測2 組大鼠牙槽骨組織中RANK 和MMP-9 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of RANK and MMP-9 proteins in alveolar bone tissue of rats in two groups detected by Western blotting method

表4 2 組大鼠牙槽骨組織中RANK 和MMP-9 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of RANK and MMP-9 proteins in alveolar bone tissue of rats in two groups （n=8,x±s）

2.5加力3周時大鼠牙周組織中破骨細胞數、RANK和MMP-9蛋白表達水平與p-p38表達水平的相關性分析加力3 周時大鼠牙周組織中破骨細胞數、RANK 和MMP-9 蛋白表達水平與p-p38 表達水平均呈正相關關系（P＜0.05）。見表5。

表5 加力3 周時大鼠牙周組織中破骨細胞數、RANK 和MMP-9 蛋白表達水平與p-p38 表達水平的相關性Tab.5 Correlations between osteoclast number, RANK and MMP-9 protein expression levels and expression level of p-p38 in periodontal tissue of rats 3 weeks after stressing

3 討 論

牙槽骨是不斷更新的組織之一，由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收的動態平衡維持正常的骨代謝過程［6］。骨吸收要通過破骨細胞的活化完成，成熟的破骨細胞形態為橢圓形或圓形，形態不規則，直徑10～100 μm，隨著細胞的老化，破骨細胞的胞漿從嗜堿性轉化為嗜酸性。破骨細胞的成熟在骨形態維持和骨重建中發揮重要作用［7］。在正畸治療中，破骨細胞的生成和分化在牙齒移動過程中發揮重要作用，破骨細胞生成過多促進牙齒移動，反之破骨細胞生成過少抑制牙齒移動［8-9］。本研究中，對正畸治療模型大鼠給予骨保護素治療，發現骨保護素可抑制壓力側破骨細胞數量，抑制牙齒移動，抑制牙槽骨中RANK 和MMP-9 蛋白表達。 RANK 為破骨細胞的表型標志物， RANK水平升高表明破骨細胞數增加［10］。MMP-9 為破骨細胞活化的標志物，MMP-9 水平升高表明破骨細胞活化，骨吸收活性增加［11］。RANK 和MMP-9 蛋白水平降低表明破骨細胞的生成和活化受到抑制。本研究結果表明：骨保護素具有抑制牙齒移動的作用，其機制可能為骨保護素可抑制破骨細胞生成和分化。正畸治療過程中支抗牙的控制為重要環節，破骨細胞生成和活化在牙齒移動中發揮重要作用［21］；骨保護素具有抑制破骨細胞生成和活化的作用，且骨保護素的代謝產物容易排泄，不會在局部沉積，故骨保護素可用于正畸治療，抑制牙齒移動，增加支抗作用［13-14］。牙齒移動過程中， 加力7 d 后即開始出現修復，破骨成骨趨向于一個平衡狀態，本研究結果顯示：破骨吸收活性延后，在加力1 周時壓力側牙槽骨形成破骨細胞，加力2 周時牙槽骨局部出現潛掘性吸收，鄰近牙槽骨出現大量破骨陷窩；加力3 周時破骨陷窩進一步增加，潛掘性吸收繼續，出現廣泛骨吸收。

MAPK 信號通路在破骨細胞的生成及活化中發揮重要作用，p38-MAPK 為MAPK 信號通路中的一條重要的信號通路［15-16］，破骨細胞及其前體的RANK 可 激 活p-p38， p38 具 有 活 性， 激 活 的p38-MAPK 通路參與破骨細胞的形成過程［17-18］。骨保護素可通過多種信號通路發揮作用，ZHAO 等［19］發 現： 骨 保 護 素 通 過 鈣、 ERK 和p38-MAPK 信號通路誘導破骨細胞中的足小體分解，由此推測骨保護素可能通過p38-MAPK 信號通路參與正畸治療的牙齒移動過程。本研究結果顯示：骨保護素治療可抑制牙槽骨組織中p-p38 表達水平升高，表明骨保護素在正畸治療過程中可抑制p38-MAPK 信號通路激活。本研究結果顯示： 牙周組織中破骨細胞數、RANK 和MMP-9 蛋白表達水平與p-p38 表達水平均呈正相關關系，表明骨保護素抑制正畸治療大鼠第一磨牙移動的作用機制可能為骨保護素抑制牙槽骨組織中p38-MAPK 信號通路激活，p38-MAPK 信號通路失活可抑制破骨細胞的生成和分化，從而抑制正畸牙齒移動，發揮增加正畸支抗作用。

綜述所述，骨保護素在正畸治療中可發揮支抗作用，其機制可能為骨保護素抑制p38-MAPK 信號通路激活，進一步抑制破骨細胞生成和分化，從而發揮抑制牙齒移動的作用。