雷公藤內酯醇對類風濕性關節炎模型大鼠血管新生和PTEN/PI3K/AKT 通路的影響

劉 靜, 燕麗君

（河北醫科大學附屬唐山工人醫院風濕免疫科，河北 唐山 063000）

中醫認為類風濕性關節炎的發生與營衛和風寒濕有關，多采用活血養陰、扶正祛邪及祛風除濕等中藥治療方法［1］。雷公藤為治療類風濕性關節炎療效比較顯著的中藥，具有通絡止痛、祛風除濕、解毒殺蟲和消腫止痛等功效［2］，雷公藤內酯醇為其有效成分，具有抗炎和免疫抑制作用［3］。研究［4］顯示：雷公藤內酯醇在類風濕性關節炎中發揮作用，但其作用機制尚不清楚。本研究探討雷公藤內酯醇對類風濕性關節炎大鼠血管新生和第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因/磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/phosphoinositide-3-kinse/protein kinase B， PTEN/PI3K/AKT） 通 路的影響，分析雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎的可能機制。雷公藤內酯醇在類風濕性關節炎中具有抗炎作用，但其作用機制尚不清楚，本研究從作用機制方面探討雷公藤內酯醇在類風濕性關節炎治療中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器雄性、清潔級、健康、SD 大鼠80 只，體質量150～170 g、購自北京市醫療器械檢驗所，動物使用許可證號：SYXK（京） 2015-0005。雷公藤內酯醇（中國藥品生物制品鑒定所），雙氯芬酸鈉緩釋片（北京諾華制藥有限公司），弗氏完全佐劑（美國Sigma 公司），微血管密度（microvessel density， MVD） 和血管內皮生 長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 酶 聯 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme linked immunosorbent assay ， ELISA） 試 劑 盒（ 美 國Bioworld 公司），山羊抗鼠CD31 多克隆抗體、兔抗鼠VEGF 多克隆抗體、兔抗鼠PTEN 單克隆抗體、兔抗鼠PI3K 單克隆抗體、兔抗鼠AKT 單克隆抗體和兔抗鼠磷酸化AKT （p-AKT） 單克隆抗體等抗體（美國Santa cruz 公司）。酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2動物分組和模型制備將80 只大鼠隨機分為對照組、模型組、 治療組和陽性藥物組， 每組20 只。除對照組外，其余各組均建立類風濕性關節炎模型。建模方法：將15 mg Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）溶于7.5 mL 濃度為0.1 mol·L－1的醋酸中，唾液充分溶解；第2 天在冰浴中與弗氏完全佐劑等體積混合， 充分乳化制成15 mL 乳化劑， 置于冰箱中4℃保存。在大鼠左后肢足趾皮內注射0.1 mL 乳化劑致炎，第7 天在大鼠尾部和背部多點皮內注射0.1 mL 乳化劑激發；對照組相同部位相同方法注射等量生理鹽水；大鼠左足明顯紅腫和體積增大表明造模成功［5］。

1.3給藥方法造模2 周后，剔除造模不成功大鼠，納入實驗大鼠：對照組大鼠20 只（無死亡）、模型組大鼠17 只（造模過程中死亡2 只，造模不成功1 只）、治療組大鼠19 只（造模不成功1 只，無死亡大鼠） 和陽性藥物組大鼠18 只（死亡1 只，造模不成功1 只）。治療組大鼠給予雷公藤內酯醇灌胃（6 mg·kg－1），每天灌胃1 次［6］；陽性藥物組大鼠給予雙氯芬酸灌胃（10 mg·kg－1）， 每天灌胃1 次； 模型組和對照組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天灌胃1 次，共3 周。治療后，觀察各組大鼠精神狀態、進食量和活動情況等一般狀態；采用天平秤稱取各組大鼠體質量；采用細角圓規和毫米直尺測定各組大鼠足爪厚度；采用關節炎評分法（0～4 級） 評估關節炎指數積分：無紅腫為0 分，趾關節紅腫為1 分，趾關節和足趾腫脹為2 分，踝關節以下足爪腫脹為3 分，包括踝關節的全部足爪腫脹為4 分。四肢關節炎指數積分之和為每只大鼠關節炎指數積分，最高分為16 分［7］。

1.4標本采集治療結束后，水合氯醛腹腔麻醉大鼠，斷頭處死； 斷頭時抽取5 mL 大鼠全血，1 000 r·min－1離心15 min，留取血清用于ELISA 檢測；斷頭后立即剪取雙側踝關節，將皮毛、肌肉和筋膜剔除，將踝關節滑膜組織分為兩部分，一部分置于甲醛中固定24 h，加入脫鈣液脫鈣1 周，加入硫代硫酸鈉溶液中和3 h，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切成厚5 μm 切片用于HE 和免疫組織化學染色； 另一部分關節滑膜組織置入液氮中， 用于Western blotting 檢測。

1.5 HE染色檢測各組大鼠關節滑膜組織病理形態表現將關節滑膜石蠟切片置于烤箱中烤干，采用二甲苯脫蠟，經乙醇水化；進行常規HE 染色：置入蘇木精中染色15 min，鹽酸乙醇分化30 s，置入伊紅中染色3 min；梯度酒精脫水，封固，光鏡下觀察滑膜組織病理形態表現。

1.6免疫組織化學法檢測各組大鼠關節滑膜組織中MVD和VEGF表達水平取石蠟組織脫蠟水化，置于EDTA 抗原修復緩沖液中修復抗原，加入過氧化氫溶液孵育15 min 阻斷內源性過氧化物酶，置于PBS 液中脫色搖床洗滌，加入兔血清封閉30 min，加入一抗：山羊抗鼠CD31 多克隆抗體（1∶100）、兔抗鼠VEGF 多克隆抗體（1∶200），過夜孵育，加入二抗孵育1 h，加入DAB 顯色液顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。滑膜組織中被染色成棕黃色、與周圍組織明顯分開的內皮細胞族為單個微血管；在200 倍視野下， 采用Image-Pro Plus6.0 軟件計算微血管個數及組織面積， MVD= 微血管個數/組織面積（mm－2）。VEGF 免疫組織化學染色結果判定標準：細胞核和細胞漿被染成棕黃色為VEGF 陽性細胞，200 倍視野下拍照觀察細胞染色情況， 采用Image-Pro Plus6.0 軟件分析陽性細胞的累積吸光度（IA） 值。

1.7 ELISA法檢測各組大鼠血清VEGF水平取各組大鼠血清，采用雙抗體夾心ELISA 法檢測各組大鼠血清VEGF 水平，操作步驟按說明書進行，測量波長450 nm 處A 值，繪制標準曲線，以A 值代表血清VEGF 水平。

1.8 Western blotting法檢測各組大鼠滑膜組織中PTEN、PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達水平取約100 mg 滑膜組織，加入裂解液提取總蛋白，采用Bradford 法測定組織蛋白濃度，制備SDS-PAGE 凝膠， 取50 μg 蛋白上樣， 80 V 恒壓電泳， 濕法轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗：兔抗鼠PTEN單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗鼠PI3K 單克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠AKT 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗鼠p-AKT 單克隆抗體（1∶1 000）， 過夜孵育；加入二抗（1∶5 000） 孵育1 h，顯影、曝光后， 采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內參照，計算目的蛋白表達水平。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.9統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠體質量、足爪厚度、關節炎指數積分，大鼠關節滑膜組織中MVD 和VEGF 表達水平和血清VEGF 表達水平，關節滑膜組織中PTEN、PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表達水平經F檢驗顯示方差齊性，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD 檢驗，類風濕性關節炎大鼠足爪厚度、關節炎指數、 MVD 與其他指標的相關性分析采用Person 相關分析法。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況對照組大鼠飲食和活動等無明顯異常；模型組大鼠食欲減退、體質量增加緩慢、活動量減少、行動遲緩；陽性藥物組和治療組大鼠飲食和活動較模型組明顯改善。

2.2各組大鼠體質量、足爪厚度和關節炎指數積分與對照組比較，模型組大鼠體質量降低（P＜0.05）， 足爪厚度升高（P＜0.05）； 與模型組比較， 陽性藥物組和治療組大鼠體質量升高（P＜0.05），足爪厚度降低（P＜0.05），關節炎指數積分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量、足爪厚度和關節炎指數積分Tab.1 Body weights, paw thickness and arthritis index scores of rats in various groups （± s）

表1 各組大鼠體質量、足爪厚度和關節炎指數積分Tab.1 Body weights, paw thickness and arthritis index scores of rats in various groups （± s）

“ － ”： No data.*P＜0.05 compared with control group ；Δ P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 Body weight（m/g）10.84±0.92 8.11±0.87*9.10±0.86Δ 9.02±0.91Δ 30.881 0.000 Paw thickness（l/mm）5.78±0.24 8.65±0.33*6.93±0.31Δ 6.91±0.28Δ 302.636 0.000 Arthritis index score－7.32±0.94 6.38±0.92Δ 6.47±0.89Δ 5.591 0.006

2.3各組大鼠滑膜組織形態表現對照組大鼠滑膜組織未見異常；模型組大鼠滑膜組織見大量新生血管和炎癥細胞浸潤、滑膜組織增生；陽性藥物組和治療組大鼠滑膜組織新生血管和炎癥細胞數減少，其中治療組大鼠滑膜組織新生血管和炎癥細胞數減少更明顯。見圖1 （插頁七）。

2.4各組大鼠滑膜組織中MVD 與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中MVD 升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組和陽性藥物組大鼠滑膜組織中MVD 降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，治療組大鼠滑膜組織中MVD 降低（P＜0.05）。見圖2（插頁七） 和表2。

表2 各組大鼠滑膜組織中MVD 和VEGF 表達水平Tab.2 MVD and expression levels of VEGF in synovial tissue of rats in various groups （± s）

表2 各組大鼠滑膜組織中MVD 和VEGF 表達水平Tab.2 MVD and expression levels of VEGF in synovial tissue of rats in various groups （± s）

*P＜0.05 Compared with control group；ΔP＜0.05 compared with model group；＃P ＜0.05 compared with positive drug group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 MVD（S/mm－2）9.35±1.02 104.36±3.57*66.29±3.18Δ 48.77±3.25Δ#3431.055 0.000 VEGF 18.21±1.97 143.24±2.76*96.35±2.64Δ 81.02±2.51Δ#8125.035 0.000

2.5各組大鼠滑膜組織中VEGF表達水平與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中VEGF 表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和治療組大鼠滑膜組織中VEGF 表達水平降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，治療組大鼠滑膜組織中VEGF 表達水平降低（P＜0.05）。 見圖3（插頁七） 和表2。

2.6各組大鼠血清VEGF水平與對照組比較，模型組大鼠血清中VEGF 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較， 陽性藥物組和治療組大鼠血清VEGF 水平降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，治療組大鼠血清VEGF 水平降低（P＜0.05）。見表3。

2.7各組大鼠滑膜組織中PTEN/PI3K/AKT通路相關蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中PTEN 蛋白表達水平降低（P＜0.05），PI3K、 AKT 和p-AKT 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和治療組大鼠滑膜組織PTEN 蛋白表達水平升高（P＜0.05），PI3K、 AKT 和p-AKT 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，治療組大鼠滑膜組織中PTEN 蛋白表達水平升高（P＜0.05）， PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表 達水平 降低（P＜0.05）。見圖4 和表4。

表3 各組大鼠血清VEGF 水平Tab.3 Levels of serum VEGF of rats in various groups[±s,ρB/(ng·L－1）]

表3 各組大鼠血清VEGF 水平Tab.3 Levels of serum VEGF of rats in various groups[±s,ρB/(ng·L－1）]

*P＜0.05 compared with control group；ΔP＜0.05 compared with model group；＃P＜0.05 compared with positive drug group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 VEGF 38.67±4.21 73.26±4.85*53.24±4.98Δ 46.23±5.02Δ＃174.773 0.000

圖4 Western blotting 法檢測各組大鼠滑膜組織中PTEN、PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of PTEN, PI3K,AKT , and p - AKT proteins in synovial tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

2.8類風濕性關節炎大鼠足爪厚度、關節炎指數和MVD與其他指標的相關性類風濕性關節炎大鼠的足爪厚度和關節炎指數與VEGF 及p-AKT 呈正相關關系（P＜0.05）， 與PTEN 呈負相關關系（P＜0.05）；MVD 與VEGF、PI3K 和p-AKT 呈正相關關系（P＜0.05）， 與PTEN 呈負相關關系（P＜0.05）。見表5。

3 討 論

類風濕性關節炎的主要表現為關節滑膜炎癥，為一種全身性、慢性、自身免疫性疾病，其病理特點為滑膜增生、血管翳形成和多種炎癥細胞浸潤，最終引起骨質破壞和關節畸形等［8］。滑膜新生的血管翳是類風濕性關節炎滑膜增生、關節軟骨損害和周圍組織損害的主要因素［9］，抑制滑膜組織血管新生是治療類風濕性關節炎的途徑之一。

本研究采用雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎模型大鼠發現：治療組大鼠足爪厚度和關節炎指數積分降低，滑膜組織新生血管和炎癥細胞減少，滑膜組織中MVD 降低，滑膜組織和血清中VEGF 表達水平降低。血管新生在類風濕性關節炎早期和活動期比較活躍，滑膜血管新生的發生與多種因子關系密切，VEGF 為最具內皮特異性的一種生長因子，可促進血管新生，參與多種疾病的發生發展過程［10］；VEGF 與其受體相互作用在類風濕性關節炎血管翳形成、軟骨和骨組織的破壞中發揮重要作用，其水平升高表明血管新生增加［11］。在西醫水平目前尚無確切的靶向治療藥物。中醫認為［12］活動期類風濕性關節炎的主要病因病機為風寒濕邪入侵，導致氣血壅滯不通、痹阻脈絡，從而出現關節紅腫疼痛，故認為濕熱淤阻是活動期類風濕性關節炎病機的關鍵。雷公藤具有祛風除濕、消腫止痛、清熱解毒和活血通絡等功效［13］，雷公藤內酯醇作為雷公藤的主要有效成分，也具有雷公藤的祛風除濕、 消腫止痛、 清熱解毒和活血通絡等功效［14］。故分析雷公藤內酯醇在類風濕性關節炎中通過祛風除濕、消腫止痛、清熱解毒、活血通絡發揮消除關節紅腫疼痛的功效［15］；研究［16］顯示：雷公藤內酯醇具有抑制血管生長的作用，故本研究中雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎的機制可能與其可抑制血管新生有關聯。與陽性藥物雙氯芬酸鈉比較，雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎的效果與雙氯芬酸鈉相當，但其抑制血管新生的作用優于雙氯芬酸鈉，表明雷公藤內酯醇可能通過抑制血管新生發揮對類風濕性關節炎的治療作用。

表4 各組大鼠滑膜組織中PTEN/PI3K/AKT 通路相關蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of PTEN, PI3K, AKT ，and p-AKT proteins in synovial tissue of rats in various groups （± s）

表4 各組大鼠滑膜組織中PTEN/PI3K/AKT 通路相關蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of PTEN, PI3K, AKT ，and p-AKT proteins in synovial tissue of rats in various groups （± s）

*P＜0.05 compared with control group；ΔP＜0.05 compared with model group；＃P＜0.05 compared with positive drug group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 PTEN 0.96±0.15 0.37±0.11*0.52±0.14Δ 0.83±0.15Δ＃70.187 0.000 PI3K 0.09±0.03 0.73±0.12*0.69±0.11Δ 0.35±0.08Δ＃211.478 0.000 AKT 0.08±0.02 0.43±0.05*0.39±0.03Δ 0.17±0.06Δ＃291.861 0.000 p-AKT 0.08±0.03 0.47±0.09*0.36±0.04Δ 0.22±0.05Δ＃169.944 0.000

表5 類風濕性關節炎大鼠的足爪厚度、關節炎指數和MVD與其他指標的相關性Tab.5 Correlations between paw thickness, arthritis index,MVD and other indexes of rats with rheumatoid arthritis

本研究結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中MVD 升高，滑膜組織中VEGF 表達水平升高，PTEN 蛋白表達水平降低，PI3K、AKT和p-AKT 蛋白表達水平升高；與模型組比較，治療組和陽性藥物組大鼠體質量升高，足爪厚度降低，滑膜組織中MVD 降低，滑膜組織中VEGF 表達水平降低， PTEN 蛋白表達水平升高， PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表達水平降低；與陽性藥物組比較，治療組大鼠滑膜組織中各指標改善更顯著。類風濕性關節炎血管新生的分子機制復雜，PI3K/Akt 信 號 通 路 為 經 典 的 信 號 通 路［17］。PI3K 參 與 多種信號通路，與Akt 共同組成的PI3K/Akt 信號通路在類風濕性關節炎的發生中發揮重要作用［18］。PI3K 具有調節細胞增殖、凋亡和新陳代謝的作用，在類風濕性關節炎的滑膜組織中PI3K 表達水平升高，升高的PI3K 促進Akt 磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路；活化的Akt 可磷酸化多種蛋白，介導細胞的生長發育和血管生成的調節［19］。 PTEN 為PI3K/Akt 信號通路重要的調控因子，為PI3K/Akt信號通路的負性調節蛋白，可阻止PI3K/Akt 通路激活， 從而抑制細胞生長和血管新生的形成［20］。由此可見，PTEN/PI3K/Akt 信號通路在類風濕性關節炎發病中發揮重要作用。VEGF 為滑膜血管新生的直接誘導因子，VEGF 直接作用于滑膜組織的血管內皮，刺激血管內皮細胞發生分裂和增殖，增加微血管通透性，導致血管形成［21］。VEGF 的表達受PTEN/PI3K/Akt 信號通路的調節， PTEN/PI3K/Akt 信號通路活化可誘導VEGF 轉錄增加，從而促進滑膜組織血管新生增加［22］。研究［23-24］顯示：雷公藤內酯醇可通過PI3K/AKT 信號通路發揮作用。本文作者推測：雷公藤內酯醇通過上調滑膜組織中PTEN 蛋白的表達，從而抑制PI3K/Akt信號通路的活化，減弱PI3K/Akt 信號通路活性，減弱Akt 磷酸化，從而抑制其下游的VEGF 等因子的產生，抑制滑膜組織新生血管生成，發揮對類風濕性關節炎的治療作用。本文作者發現：類風濕性關節炎大鼠的足爪厚度和關節炎指數與VEGF 及p-AKT 呈正相關關系， 與PTEN 呈負相關關系；MVD 與VEGF、 PI3K 和p-AKT 呈 正 相 關 關 系，與PTEN 呈負相關關系，表明PTEN/PI3K/Akt 可以通過調控VEGF 表達參與類風濕性關節炎的發病過程，雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎的機制可能與PTEN/PI3K/Akt 通路有關聯。本研究中陽性對照藥物雙氯芬酸鈉對PTEN/PI3K/Akt 信號和血管生成也有一定的調控作用， 但其在調控PTEN/PI3K/Akt 信號和血管生成方面，雷公藤內酯醇較陽性對照藥物雙氯芬酸鈉更具優勢。至于陽性對照藥物雙氯芬酸鈉對PTEN/PI3K/Akt 信號和血管生成的作用機制尚不清楚，目前也尚無相關方面的研究， 尚需以后通過進一步實驗進行研究探討。

綜上所述，雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎效果顯著， 其機制可能與其可調控PTEN/PI3K/Akt 信號通路，從而調節滑膜內血管形成有關聯。雷公藤內酯醇治療類風濕性關節炎的療效與雙氯芬酸鈉相當，但在調控滑膜內血管新生方面優于雙氯芬酸鈉。