川陳皮素對人前列腺癌DU145 細胞生長的抑制作用及其機制

張 陽, 姜華茂

（錦州醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，遼寧 錦州 121000）

隨著病情的發展，絕大多數前列腺癌患者，最終會進入 “去勢抵抗” 階段，嚴重影響患者的生存質量和生存時間。目前，對去勢抵抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer， CRPC） 尚 缺 乏規范有效的治療方法，因此迫切需要尋找有效的治療方法和藥物來延緩CRPC 的進展。 川陳皮素（5， 6， 7， 8， 3'， 4'-hexameth-oxy flavone） 是一種多甲氧基黃酮類化合物，提取于陳皮［1］，具有抗腫瘤［2］、抑制炎癥介質產生［3］和抗神經退行性病變［4］等 多 種 藥 理 作 用。已 有 研 究［5-7］表 明：川 陳皮素在神經膠質瘤、肺癌和肝癌等細胞中具有一定程度的抗腫瘤作用，但川陳皮素在雄激素非依賴性前列腺癌DU145 細胞中的作用及其機制尚未明確。在前列腺癌的發生發展過程中，MAPK 通路是非常關鍵的信號轉導通路。MAPK 通路與細胞凋亡有密切關聯［8］， 其中磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase， p-JNK）和磷酸化P38 絲裂原活化蛋白酶（phosphorylated P38 mitogen activated protease， p-P38） 可以促進細胞凋亡［9］， 而磷酸化細胞外調節蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，p-ERK） 可以抑制細胞凋亡［10］。本研究通過體外培養人前列腺癌DU145 細胞，并采用不同濃度川陳皮素處理DU145 細胞，研究其對前列腺癌DU145 細胞生長的抑制作用，并探討其作用機制，為去勢抵抗性前列腺癌尋找新的治療藥物并提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1細胞、藥物、主要試劑和儀器人前列腺癌DU145 細胞購自沈陽百思生物有限公司。川陳皮素（純度≥98%，批號H25A8K42328） 購自上海源葉生物科技有限公司。RPMI-1640 培養基和胰酶購自美國Gibco 公司，胎牛血清、超敏ECL 化學發光試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和凝膠快速制備試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司，MTT 粉末和脫脂牛奶購自北京索萊寶科技有限公司， DMSO 購 自 美 國Sigma 公 司， 一 抗JNK 、p-JNK、P38、p-P38、ERK、p-ERK 和GAPDH 及其對應的二抗均購自北京博奧森生物科技有限公司，Transwell 小室和凋亡試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司，Matrigel 基質膠購自美國BD 公司， 全蛋白提取試劑盒購自上海BestBio 公司。CO2培養箱購自上海Blue Pard 儀器有限公司，蛋白電泳及轉膜裝置購自美國Bio-Rad 公司，全波長酶標儀購自瑞士Tecan 貿易股份有限公司，流式細胞儀購自賽默飛世爾科技（中國） 有限公司。

1.2細胞培養采用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 完全培養基，于細胞培養箱（37 ℃、5% CO2）中培養人前列腺癌DU145 細胞。

1.3 MTT法檢測各組人前列腺癌DU145細胞增殖活性取對數生長期人前列腺癌DU145 細胞100 μL （5×103μL－1） 接種于96 板孔中在細胞培養箱中（37 ℃、5% CO2） 培養24 h，待細胞完全貼壁后， 分別加入含有不同濃度（0、 0.8、 1.6、3.2、 6.4、 12.8、 25.6 和51.2 μmol·L-1） 川 陳 皮素的完全培養基作為不同濃度川陳皮素組，并設置對照組，對照組為含10% 胎牛血清的RPMI-1640完全培養基。在培養箱中繼續孵育24、48 和72 h，向培養基中加入MTT 溶液， 至MTT 終濃度為5 g·L－1，37 ℃繼續培養4 h，待MTT 被細胞攝取后，棄去MTT 液，向各孔加入150 μL DMSO，在酶聯反應檢測儀上檢測各組細胞在570 nm 波長處的吸光度（A） 值，以細胞增殖活性表示川陳皮素對人前列腺癌DU145 細胞增殖的影響。細胞增殖活性=藥物組A 值/對照組A 值×100%。

1.4劃痕實驗檢測各組人前列腺癌DU145細胞遷移能力取對數生長期人前列腺癌DU145 細胞接種于6 孔板中，每孔加入1.0×105個細胞，待細胞完全貼壁后，在孔中央橫軸方向采用200 μL 槍頭劃出1 條劃痕后分別加入不同濃度（0、 12.8 和25.6 μmol·L－1） 川陳皮素，倒置顯微鏡觀察劃痕狀態拍照后放入培養箱中繼續培養， 分別于6、12、24 和48 h 取樣，倒置顯微鏡觀察各組細胞的劃痕狀態。以細胞劃痕愈合率代表川陳皮素對人前列腺癌DU145 細胞遷移能力的影響。細胞劃痕愈合率= （初始細胞劃痕寬度－ 實際細胞劃痕寬度） /初始細胞劃痕寬度×100%。

1.5 Transwell法檢測各組人前列腺癌DU145細胞侵襲能力在24-Transwell 小室的上室均勻涂布1 g·L－1Matrigel 基質膠，37℃下放置4 h，取對數生長期DU145 細胞， 消化后稀釋密度為1×105mL－1細 胞 懸 液 加 入24-Transwell 小 室 的 上室，隨機分為對照組、12.8 μmol·L－1川陳皮素組和25.6 μmol·L－1川 陳 皮 素 組， 24-Transwell 小 室的下室加入含10% 胎牛血清的完全培養基作為趨化因子，置于37 ℃和5% CO2培養箱孵育48 h。取出上室，采用0.1% 結晶紫染色并清除未侵襲的細胞，然后對侵襲的細胞進行拍照，采用ImageJ 軟件進行圖像分析。以相對侵襲細胞數表示川陳皮素對人前列腺癌DU145 細胞侵襲能力的影響。

1.6流式細胞術檢測各組人前列腺癌DU145細胞凋亡率對照組、 12.8 μmol·L－1川陳皮素組和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細胞培養48 h 后采用胰蛋白酶消化后PBS 漂洗2 次，并進行細胞計數， 離心收集5×105個細胞， 加入500 μL Binding buffer 重懸細胞，加入5 μL APC 混勻后，加入10 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應5～15 min，1 h 內采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率= （早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數） /細胞總數×100%。

1.7 Western blotting法檢測各組細胞中p-JNK、p-P38和p-ERK蛋白表達水平人前列腺癌DU145 細胞經川陳皮素作用48 h 后，采用胰酶消化收集細胞，PBS 洗滌2 次，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，BCA 法測定蛋白質濃度。每孔按10 μg 蛋白樣品上樣， 12% SDS-PAGE 分離蛋白，80 V 恒壓濕轉30 min 后轉110 V 恒壓濕轉60 min，300 mA 恒流轉膜90 min，5% 脫脂牛奶封閉2 h ， 然 后 分 別 用p-JNK （1 ∶500）、 p-P38（1 ∶500）、p-ERK （1∶500） 一抗4℃搖床孵育過夜12 h， HRP 標 記 的 二 抗（1 ∶5 000） 室 溫 孵育2 h，ECL 顯影液顯影，凝膠成像系統拍照并采用Image J 軟件進行圖像分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白（GAPDH） 條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達水平。

1.8統計學分析采用GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖活性、劃痕愈合率、侵襲細胞數、細胞凋亡率和細胞中p-JNK、p-P38 及p-ERK 蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。 檢驗水準α =0.05。

2 結 果

2.1各組人前列腺癌DU145細胞增殖活性0.8、1.6、 3.2、 6.4、 12.8、 25.6 和51.2 μmol·L－1川陳皮素處理人前列腺癌DU145 細胞24、48 和72 h后，人前列腺癌DU145 細胞增殖活性隨著藥物濃度的加大而降低，呈現時間和濃度依賴性。作用48 h 后，川陳皮素對人前列腺癌DU145 細胞的半數抑制濃度（inhibitory concentration 50， IC50） 約為51.2 μmol·L－1，因此以下實驗用藥濃度不超過51.2 μmol·L－1， 后 續 實 驗 用 藥 濃 度 選 擇25.6 和12.8 μmol·L－1。見圖1。

圖1 MTT 法檢測各組人前列腺癌DU145 細胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of human prostate cancer DU145 cells in various groups detected by MTT method

2.2各組人前列腺癌DU145細胞遷移形態表現和劃痕愈合率處理人前列腺癌DU145 細胞6、12、24 和48 h 后，12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細胞劃痕愈合率較對照組明顯降低（P＜0.01），并且細胞劃痕愈合率隨著藥物濃度的增多而降低，呈現濃度依賴性。各組人前列腺癌DU145 細胞遷移形態表現見圖2 （插頁八），各組胞劃痕愈合率見圖3。

圖3 各組人前列腺癌DU145 細胞劃痕愈合率Fig.3 Scratch healing rates of human prostate cancer DU145 cells in various groups

2.3各組人前列腺癌DU145細胞侵襲細胞數處理48 h 后， 12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細胞的侵襲細胞數較對照組明顯降低（P＜0.01），且其侵襲細胞數隨著藥物濃度的增加而降低。見圖4 （插頁八） 和圖5。

圖5 各組人前列腺癌DU145 細胞的侵襲細胞數Fig.5 Number of invasion cells of human prostate cancer DU145 cells in various groups

2.4各組人前列腺癌DU145細胞凋亡率處理48 h 后，12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細胞凋亡率較對照組明顯升高（P＜0.01），并且細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加。見圖6 和圖7。

圖6 流式細胞術檢測各組人前列腺癌DU145 細胞凋亡率Fig.6 Apoptotic rates of human prostate cancer DU145 cells in various groups detected by flow cytometry

2.5各組人前列腺癌DU145細胞中p-JNK、p-P38和p-ERK蛋白表達水平作用48 h 后，與對照組比較，12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前腺癌DU145 細胞中p-JNK 和p-P38 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）， p-ERK 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖8 和圖9。

3 討 論

前列腺癌是美國男性中最常見的惡性腫瘤［11］。但是在發展中國家，這類癌癥的發病率也呈逐年升高［12］。這可能與人均壽命的延長、飲食結構的改變和診斷技術的不斷提高有密切關聯。目前，早期前列腺癌應用根治性手術或根治性放療均可以有效控制其發展［13-14］。大部分局部進展期前列腺癌和轉移性前列腺癌一般選擇雄激素去勢治療為主的姑息性治療［15］。絕大多數前列腺癌患者經過手術或者藥物去勢治療之后，在一定時間內，腫瘤生長均能得到一定程度的抑制。但是隨著病情的進展，最終會進入 “去勢抵抗” 階段［16］。而目前針對去勢抵抗性前列腺癌， 尚缺少統一規范的治療方法［17］。一般可選擇的方法有化療、 免疫治療和靶向治療［18］。這3 種治療方式價格昂貴，但是療效卻不是十分明顯，而且化療的不良反應也較多，患者依從性差。因此，迫切需要尋找針對去勢抵抗性前列腺癌治療的新方法。

圖7 各組人前列腺癌DU145 細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of human prostate cancer DU145 cells in various groups

圖8 Western blotting 法檢測各組人前列腺癌DU145 細胞中p-JNK、p-P38 和p-ERK 蛋白表達電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of p-JNK,p-P38, and p-ERK proteins in human prostate cancer DU145 cells in various groups detected by Western blotting method

圖9 各組人前列腺癌DU145 細胞中p-JNK、p-P38 和p-ERK 蛋白表達水平Fig.9 Expression levels of p-JNK, p-P38, and p-ERK proteins in human prostate cancer DU145 cells in various groups

天然產物或植物來源的生物活性化合物已經在癌癥化療中獲得了越來越多的關注，因為其被認為具有更高的生物反應性和與靶點的協同進化性，對正常細胞的毒性也較小［19］。陳皮是從柑橘屬植物中培育出來的一種成熟的果皮，其中主要生理活性成分——川陳皮素，具有多種藥理作用，主要包括抑制腫瘤生長、抑制炎癥介質產生、抑制氧化應激、抗糖尿病胰島素抵抗、保護骨骼、減少骨吸收、抗過敏、抗心血管功能紊亂和抗神經退行性病變等作用。已證實其在甲狀腺癌［20］、肺癌［21］、膀胱 癌［22］、 腎 癌［23］、 鼻 咽 癌［24］和 口 腔 鱗 狀 細 胞癌［25］等組織中均有明顯的抑癌作用。在人前列腺癌細胞中，較常用于研究的有LNCaP 細胞（激素依賴性）、PC3 細胞（雄激素非依賴性） 和DU145細胞（雄激素非依賴性），其中DU145 細胞的惡性程度和轉移潛能最高，同時是一種不含雄激素受體的細胞株，主要用于晚期去勢抵抗性前列腺癌研究［26］。本課題組通過體外實驗證實了川陳皮素對人前列腺癌DU145 細胞具有抗腫瘤作用。川陳皮素不僅可以抑制前列腺癌DU145 細胞的生長，降低其遷移能力和侵襲能力，并且可以促進DU145細胞凋亡。前列腺癌發生發展的機制與多種信號轉導通路有關聯，其中MAPK 就是非常關鍵的一條通路。MAPK 中ERK 是目前研究最深入的信號通路，其與細胞增殖和分化密切相關，而JNK 和P38主要與細胞凋亡有關聯。

經過不同濃度（0、12.8 和25.6 μmol·L－1） 川陳皮素處理人前列腺癌DU145 細胞48 h 后，細胞中p-JNK 和p-P38 的表達水平明顯升高，而P-ERK的表達水平降低， 提示川陳皮素在人前列腺癌DU145 細胞中發揮抗腫瘤作用，其抑制細胞生長、促進細胞凋亡的作用可能與MAPK 途徑上相關蛋白表達的改變有密切關系，但是這一機制需要通過抑制劑進行進一步實驗證實。

綜上所述，川陳皮素在人前列腺癌DU145 細胞中有良好的抗癌活性，是潛在的治療前列腺癌的藥物，但未來需要對川陳皮素用于動物實驗作用進行進一步研究。