組織內AEG-1表達情況對葡萄膜黑色素瘤病理特征的影響

楊晉波 鄭增光 楊世峰 鄭林峰

[摘要] 目的 探究組織內星形膠質細胞活化基因-1（AEG-1）表達情況對葡萄膜惡性黑色素瘤（UM）病理特征的影響。 方法 選取2016年3月～2018年8月我院眼科診治的62例（62眼）于病理室存放的UM石蠟組織標本納入研究組。并選取同期20例（20眼）因外部原因受傷采取眼球摘除術但少量UM或絕大部分葡萄膜組織正常的石蠟組織標本作為對照組。對比分析兩組患者AEG-1基因表達情況以及AEG-1表達情況與UM病理特征的相關性。 結果 UM 組織中AEG-1 mRNA相對表達量為（1.09±0.05），正常葡萄膜膜組織中AEG-1 mRNA相對表達量為（1.01±0.12），差異有統計學意義（P<0.05）;研究組62例（62眼）AEG-1陽性表達為37眼（59.68%），陰性表達為25眼（40.32%）;對照組20例（20眼）AEG-1均呈陰性表達，差異有統計學意義（P<0.05）;腫瘤高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導管、眼外生長、視盤受累以及繼發視網膜脫落與AEG-1高表達均有明顯相關性（P<0.05）。結論 UM高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導管、眼外生長、繼發視網膜脫落及視盤受累病理特征均與AEG-1的高表達具有密切聯系，顯著影響UM轉移風險和預后，為UM臨床診斷和治療提供有效參考。

[關鍵詞] 葡萄膜黑色素瘤;星形膠質細胞活化基因-1;基因表達;病理特征

[中圖分類號] R739.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）22-0139-04

Effect of AEG-1 expression in tissues on pathology features of uveal melanoma

YANG Jinbo? ?ZHENG Zengguang? ?YANG Shifeng? ?ZHENG Linfeng

Pathology Department， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To explore the effect of astrocyte elevated gene-1（AEG-1） expression in tissues on pathology features of uveal melanoma（UM）. Methods Sixty-two（62 eyes） UM paraffin-embedded tissue specimens stored in the pathology room from patients treated in the department of ophthalmology in our hospital from March 2016 to August 2018 were enrolled in the research group. Twenty（20 eyes） paraffin-embedded tissue specimens from patients treated in the same period who underwent ophthalmectomy for reason of the external injury and had small amount of UM or large amount of normal uveal tissues were selected as the control group. The AEG-1 gene expression and the correlation between AEG-1 expression and pathology features of UM in the two groups were analyzed. Results It was found that the relative expression of AEG-1 mRNA in UM tissues was（1.09±0.05）， and the relative expression of AEG-1 mRNA in normal uveal tissues was（1.01±0.12）， with statistically significant differences（P<0.05）. In the research group（62 eyes）， specimens with positive expression of AEG-1 were 37（59.68%）， and specimens with negative expression of AEG-1 were 25（40.32%）; in the control group（20 eyes）， it was found that all specimens had negative expression. There were statistically significant differences in the two groups（P<0.05）. The high expression of AEG-1 was significantly correlated with tumor height>8 mm， involvement of ciliary body， invasion of sclera duct， extraocular growth， optic disc involvement， and secondary retinal detachment（P<0.05）. Conclusion The pathology features such as UM height>8 mm， involvement of ciliary body， invasion of sclera duct， extraocular growth， optic disc involvement， and secondary retinal detachment are closely related with the high expression of AEG-1， which has a significant effect on the metastasis risk and prognosis of UM， and can provide effective reference for clinical diagnosis and treatment of UM.

[Key words] Uveal melanoma; Astrocyte elevated gene-1; Gene expression; Pathology features

隨著電子產品的普及，眼部疾病的發病率日益升高，其中葡萄膜惡性黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一種眼睛內部的原發性惡性腫瘤，其發病率高、預后差、轉移死亡率較高。占全身黑色素瘤的6%左右，嚴重影響人類的生命健康[1]。UM的致病原因為體內多種基因和信號傳導共同作用，據研究發現[2]，星形膠質細胞活化基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）與多數腫瘤的發病和發展具有密切聯系。AEG-1是由于人免疫缺陷病毒感染胚胎星形膠質細胞后導致其表達升高的蛋白質之一。已有研究表明，組織內AEG-1表達升高，會強化神經膠質細胞和黑色素瘤細胞的非錨定生長能力，使星形膠質細胞的抗凋亡能力增強，但其在UM中的表達情況未見詳細研究[3]。因此，探討AEG-1表達情況對UM病理特征的影響能夠有效改善UM的預后，為UM治療提供參考依據。本文就我院2016年3月～2018年8月診治的62例葡萄膜黑色素瘤患者進行了回顧分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016年3月～2018年8月眼科診治的62例（62眼）于病理室存放的UM石蠟組織標本納入研究組。并選取同期20例（20眼）因外部原因受傷采取眼球摘除術但少量UM或絕大部分葡萄膜組織正常的石蠟組織標本作為對照組。兩組患者一般臨床資料比較見表1。患者年齡、性別比例和患病眼睛等指標比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要設備和試劑

兔抗人MTDH多克隆抗體ab45338購自美國Abeam公司;AEC顯色試劑盒AEC-0037購自中國泰科蘭薄生物技術有限公司;免疫組織化學Elivision ⅢSuper試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司;Lipofectamine 2000轉染試劑和Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司;PCR擴增和逆轉錄等相關試劑盒購自德國Qiagen公司;AEG-1等相關引物由上海生工生物公司設計合成。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量? PCR術檢測兩組中AEG-1 mRNA表達? 選取兩組患者組織，進行切碎、研磨等粉碎手段，按照要求加入適量的細胞裂解液，隨后按照試劑盒說明書提取兩組患者組織中的總RNA，使用分光光度計測定提取出的RNA質量和濃度。采用說明書方法將RNA逆轉錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR儀按擴增試劑盒說明對引物進行擴增。加入引物序列，具體為AEG-1：上游：5'-AAG CAGTGCAAAACAGTTCACG-3'，下游：5'-GCACCTTATCACGTTACGCT-3'，擴增片段大小為121 bp;內參引物為GAODH：上游：5'-TGACTTCAACAGCGACACCC-3'，下游5' -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴增片段大小為111 bp。整個反應過程：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，循環60次。整個過程中每個樣品設置3個平行反應復孔。采用2-△△Ct法獲得兩組患者組織中AEG-1 mRNA相對表達量。

1.3.2 免疫組織化學檢測AEG-1表達情況? 將兩組石蠟組織進行連續切片各5張，厚度大約為3 μm，選取1張蘇木精-伊紅染色進行病理診斷和相關分類，另選1張作為對照以PBS替代一抗染色，余3張進行免疫組織化學染色。染色過程：首先采用二甲苯脫蠟處理，采用梯度乙醇梯度水化，用PBS緩沖液重復沖洗3次，每次3 min。按相關試劑盒說明書要求加入pH 9.0的EDTA抗原修復液進行微波抗原修復，緩慢低速滴加3%過氧化氫溶液進行阻斷，于室溫條件下孵育15 min;結束后立即吸去過氧化氫溶液，且采用PBS緩沖液重復清洗3次，加入兔抗人MTDH（AEG-1）多克隆抗體一抗，比例為1：200，于4℃下過夜孵育，且PBS緩沖液重復清洗3次，每次3 min。采用HRP法進行標記，具體方法為采用兔IgG聚合物，于室溫條件下孵育60 min，PBS緩沖液重復清洗3次，每次3 min;并且在所有切片上滴加新鮮配制AEC溶液，在光學顯微鏡下控制其顯色;蘇木素試劑復染5 min，采用HCl溶液分化3 s，PBS緩沖液重復清洗3次，每次3 min，水性封片劑封片。

1.3.3 免疫組織化學染色結果判定? 邀請3名病理科經驗豐富的專家對檢測結果進行分析。參考文獻[4]，以紅色或粉紅色著色為陽性著色于細胞核、細胞膜及細胞漿等位置進行判定。判定標準：①隨機挑選每張組織切片5個或以上高倍鏡視野點，統計染色細胞，評估陽性細胞數占同類細胞數的百分比情況，其中≤5%得分為0分，>5%，≤25%得分為1分;>25%，≤50%得分為2分;>50%得分為3分。②染色程度評分標準為無著色得分為0分，弱著色得分為1分，中度著色得分為2分，強著色得分為3分。最終染色結果得分=每張組織切片染色程度得分與染色細胞百分比得分之積，其中最終染色結果得分0～1分為陰性（-），得分2～3分為弱陽性（±），得分4～6分為中等陽性（+），得分>6分為強陽性（++）。本實驗將陰性（-）與弱陽性（±）合記作陰性;中等陽性（+）與強陽性（++）記作陽性。

1.4 統計學方法

本研究數據采用SPSS23.0統計學軟件進行分析，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者AEG-1 mRNA基因表達比較

研究結果顯示，UM 組織中AEG-1 mRNA相對表達量為（1.09±0.05），正常葡萄膜膜組織中AEG-1? mRNA相對表達量為（1.01±0.12），差異有統計學意義（t=4.217，P=0.000）。

2.2 AEG-1于兩組組織標本中表達情況比較

據文獻研究表明[5]，AEG-1被染色后一般為紅色或粉紅色顆粒，位置分布在UM細胞核周、細胞膜和細胞漿周圍。對比分析AEG-1于兩組組織標本中表達情況。本研究結果顯示，研究組62例（62眼）AEG-1陽性表達為37眼（59.68%），陰性表達為25眼（40.32%）;對照組20例（20眼）AEG-1均呈陰性表達，兩組相比具有顯著統計學差異（P<0.05）。見表2。

2.3 AEG-1表達情況與UM病理特征相關性分析

對比分析AEG-1表達情況與UM病理特征的相關性，不同影響因素下AEG-1表達見封三圖4～6。結果顯示，腫瘤高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導管、眼外生長、視盤受累及繼發視網膜脫落均有明顯相關性（P<0.05）。見表3。

3 討論

UM作為成人眼部的腫瘤之一，具有轉移速度快、惡性程度高、發病率高及預后差等特點，嚴重影響患者的生命健康。據研究發現，因其轉移風險尚未明確，且轉移較為隱匿，早期不易被發現，其死亡率高達50%[6]。因此，需對影響UM患者預后的相關因素進行進一步分析。近年來，有學者[7]調研發現，AEG-1為引發腫瘤細胞侵襲、抗凋亡和轉移的蛋白質之一，其中，AEG-1在UM中高表達，且與UM的預后具有相關性，但其與UM病理特征的相關性尚未有明確定論。

腫瘤的發生及發展是因為打破了細胞增生和凋亡之間的動態平衡所導致的，一旦體內細胞凋亡受到阻礙或是無限增生出現問題，即發生腫瘤[8]。在UM中存在著大量抗細胞凋亡的基因和相應參與調節的基因，AEG-1為其一。本研究采用PCR技術對比UM組織和正常葡萄膜組織中AEG-1 mRNA表達量，結果顯示，UM 組織中AEG-1 mRNA相對表達量為（1.09±0.05），正常葡萄膜膜組織中AEG-1 mRNA相對表達量為（1.01±0.12），兩組具有顯著的統計學差異（P<0.05）。該研究表明，AEG-1在正常葡萄膜組織中mRNA表達量顯著小于UM組織中，且在UM中呈現為高表達，與文獻結果一致[9]。另外，有相關研究認為[10]，AEG-1作為腫瘤生物標記物，其于視網膜母細胞瘤和神經母細胞瘤中普遍呈現高表達狀態，與本研究結果一致。本文證實AEG-1高表達與是否出現繼發視網膜脫落具有顯著相關性（P<0.05）。此外，本文探究組織內AEG-1表達情況對UM的病理特征的影響，結果顯示，AEG-1的表達情況與UM的預后具有密切關聯，與上述結果一致。首先，研究發現年齡、性別比例、患病眼睛、腫瘤直徑和腫瘤類型等指標比較均未見明顯統計學差異（P>0.05），與文獻結果不一致[11]。其他相關研究結果得出高齡、腫瘤直徑和腫瘤細胞類型與UM患者存在一定的相關性，導致該結果的原因為本研究樣本量過小。同時，為分析AEG-1于UM中的表達情況與其臨床病理特征的相關性，將腫瘤高度、是否累及睫狀體、是否侵犯鞏膜導管、是否眼外生長、是否繼發視網膜脫落以及視盤是否受累等因素進行對比分析。結果表明，當腫瘤高度>8 mm時，腫瘤細胞轉移率相較于≤8 mm細胞更高，且AEG-1陰性表達率明顯較高（P<0.05），相關文獻結果一致[12]。該結果證實腫瘤細胞高度影響AEG-1陽性表達，并且隨著腫瘤高度的增加，轉移風險增大。當葡萄膜黑色素瘤擴散至睫狀體時，多數患者存在虹膜新生血管生成情況，其會導致腫瘤轉移風險不斷增加[13-15]。本研究結果顯示，是否累及睫狀體與AEG-1表達情況具有密切聯系，且具有顯著統計學差異（P<0.05）。由此證明，AEG-1在UM組織中高表達與腫瘤累及睫狀體相關性顯著，且與其轉移風險相關。另外，UM按照其病理細胞形態被分為上皮樣細胞性、混合細胞型和上皮樣或混合細胞型三種，相關研究發現[16-18]，混合細胞型的預后與上皮樣細胞的比例具有聯系，且AEG-1表達與UM細胞類型具有顯著相關性，該結果與本文結果不同。表明本研究因樣本量較小具有一定的局限性，后期需擴大樣本量作進一步證實。本研究結果顯示，腫瘤細胞眼外生長亦為影響腫瘤轉移的影響因素，出現該現象的原因為腫瘤細胞生長于眼外，易通過血管和淋巴管，亦或是直接擴散到體內其他器官，導致腫瘤轉移風險加大[19-20]。本文對AEG-1表達情況與是否眼外生長進行相關性分析，結果發現兩者顯著相關（P<0.05）。由此說明，腫瘤眼外生長不僅與AEG-1高表達相關，且影響UM預后。

綜上所致，UM腫瘤高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導管、眼外生長、繼發視網膜脫落及視盤受累均與AEG-1的高表達具有顯著的相關性，明顯影響UM轉移風險和預后，為UM臨床診斷和治療提供有效參考。但由于本研究樣本量有限，且并未對AEG-1是否改變UM生物學行為和相關其他基因表達進行深入研究，因此，今后仍需采用生物學實驗對本研究結果進行證實。

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（收稿日期：2019-10-30）