1 株灰黃霉素產(chǎn)生菌的誘變選育 及其發(fā)酵條件優(yōu)化

羅秀針 鄭金華 林燕燕 張文華

摘 要： 以灰黃霉素產(chǎn)生菌 ji 2 為出發(fā)菌株經(jīng)過紫外線與氯化鋰誘變處理，選育出灰黃霉素效價高且發(fā)酵周期較短的菌株UL 100 80 ，其效價為 91 304 μg·mL-1 ，比出發(fā)菌株 ji 2 提高了47.8%，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，其遺傳穩(wěn)定性良好。對UL100 80 發(fā)酵條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉150g·L-1 ，NaCl 8.0g·L-1 ，CaCO 3 8.0g·L-1 ，黃豆餅粉 1.0g·L-1 ，KH 2PO 4 6.0g·L-1 ，KCl 7.0g·L-1 ，NaNO 3 1.0g·L-1 ，F(xiàn)eSO 4 1.0g·L-1 ，pH自然;優(yōu)化后的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)40 h的種子液以12%的接種量接種，28℃下培養(yǎng)12 d，灰黃霉素的效價從未優(yōu)化前的 91 304 μg·mL-1 提高到 124 965 μg·mL-1 ，提高了36.9%，與出發(fā)菌株 ji 2 相比，UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的效價提高了1.02倍，發(fā)酵時間上縮短了48 h。

關(guān)鍵詞： 灰黃霉素;誘變育種;效價;培養(yǎng)基;培養(yǎng)條件優(yōu)化

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號： 0253-2301（2020）06-0012-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.06.003

Mutation Breeding of a Griseofulin-producing Strain and the Optimization of Its Fermentation Conditions

LUO Xiu-zhen， ZHENG Jin-hua， LIN Yan-yan， ZHANG Wen-hua

（Zhangzhou Health Vocational College， Zhangzhou， Fujian 363000， China）

Abstract：By taking the griseofulin-producing strain ji-2 as the original strain， the strain UL100 80 with high potency of griseofulvin and short fermentation period was selected after the mutagenesis with ultraviolet ray and lithium chloride. The potency of the strain UL100 80 was91 304 μg·mL-1 ，which was47.8 % higher than that of the original strain ji-2， and the genetic stability was good through the continuous subculture. The fermentation conditions of UL100 80 were optimized， and the optimized liquid fermentation medium was as follows： rice flour150 g·L-1 ， NaCl8.0 g·L-1 ，CaCO 3 8.0 g·L-1 ， soybean powder1.0 g·L-1 ， KH 2PO 46.0 g·L-1 ， KCl7.0 g·L-1 ， NaNO 31.0 g·L-1 ，F(xiàn)eSO 4 1.0 g·L-1 ， and pH was natural. The optimized culture conditions were as follows： the seed solution cultured for 40 h was inoculated at 12% dose， and cultured at 28℃ for 12 d. The potency of griseofulvin was increased from91 304 μg·mL-1? before the optimization to124 965 μg·mL-1 ， with an increase of36.9 %. While compared with the original strain ji-2， the potency of griseofulvin produced by UL100 80 increased by1.02? times， and the fermentation time was shortened by 48 h.

Key words：Griseofulvin; Mutation breeding; Potency; Culture medium; Optimization of culture conditions

灰黃霉素由青霉菌 Penicillium griseofulvum 產(chǎn)生[1] ，它屬非多烯類抗真菌抗生素，臨床上普遍應用于治療皮膚和角質(zhì)層真菌感染[2] 。灰黃霉素在農(nóng)業(yè)上有著良好的應用前景[3] ，可防治多種植物病原菌[4-7] 。我國生產(chǎn)灰黃霉素的原料簡單，產(chǎn)品成本低，在國際市場上有很強的競爭力，但是灰黃霉素的發(fā)酵周期較長，一般為14 d，培養(yǎng)過程易染雜菌，且耗能大，成本高。2008年，張劍青等[8] 對灰黃霉素產(chǎn)生菌——蕁麻青霉進行基因組改良，其搖瓶效價為 8 291 μg·mL-1 ，相比原始菌提高了15%，但是改良后的菌株遺傳性狀不穩(wěn)定。黃銘杰等[9] 對灰黃霉素產(chǎn)生菌展青霉 FS80 1? 進行復合誘變，篩選出高產(chǎn)菌株液體發(fā)酵產(chǎn)灰黃霉素效價為 11 982 μg·mL-1 ，比出發(fā)菌株提高 37.52%，發(fā)酵周期為14 d，發(fā)酵周期較長。本試驗擬通過誘變育種，選育高產(chǎn)且周期較短的菌株，減少發(fā)酵過程中能耗，降低成本，提高效益，這對于工業(yè)化生產(chǎn)來說意義非凡。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 灰黃霉素產(chǎn)生菌 ji 2 由福建師范大學生命科學學院微生物實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鉀、醋酸、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：蔗糖30g·L-1 ，KCl 0.5g·L-1 ，NaNO 3 3.0g·L-1 ，MgSO 4 0.5g·L-1 ，F(xiàn)eSO 4 0.01g·L-1 ，KH 2PO 4 1.0g·L-1 ，瓊脂20g·L-1 ，pH自然。

種子培養(yǎng)基：大米 50g·L-1 ，NaNO 3 1.0g·L-1 ，NaCl 3.0g·L-1 ，CaCO 3 8.0g·L-1 ，（NH 4） 2SO 4 1.0g·L-1 ，KH 2PO 4 6.0g·L-1 ，KCl 7.0g·L-1 ，F(xiàn)eSO 4 1.0g·L-1 ，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉150g·L-1 ，NaCl 8.0g·L-1 ，CaCO 3 8.0g·L-1 ，（NH 4） 2SO 4 1.0g·L-1 ，KH 2PO 4 6.0g·L-1 ，KCl 7.0g·L-1 ，NaNO 3 1.0g·L-1 ，F(xiàn)eSO 4 1.0g·L-1 ，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 初始培養(yǎng)條件 將菌種接種到斜面培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)7～8 d后，在試管斜面加入6 mL無菌水制成菌懸液，取2 mL菌懸液接入到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃下培養(yǎng)35 h后，以15%的接種量將種子液移入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角錐瓶中，30℃下培養(yǎng)14 d。

1.2.2 灰黃霉素效價測定 繪制灰黃霉素標準曲線[10] 。采用重氮鹽法測定[11] 灰黃霉素效價，測定結(jié)果以平均值表示。

灰黃霉素效價計算公式：

灰黃霉素效價（μg·mL-1 ）= 由OD430值查得灰黃霉素濃度×稀釋倍數(shù)

1.2.3 誘變方法 紫外線與氯化鋰復合處理：將單孢子菌懸浮液置于紫外線燈（波長為2537，功率30W）下30 cm處照射，并伴以旋轉(zhuǎn)振蕩，后涂布于含1%氯化鋰的分離培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)，篩選周期較短的高產(chǎn)菌株。

1.2.4 高產(chǎn)突變菌培養(yǎng)條件優(yōu)化 （1）碳源的選擇。以等量的大米粉、燕麥粉、玉米渣、小米粉、小麥粉、麩皮粉分別作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，研究碳源對菌株

UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響。（2）氮源的選擇。分別選擇無機氮源3種：（NH 4） 2SO 4、尿素、NaNO 3，有機氮源4種：玉米粉、黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨為氮源，比較不同氮源對菌株UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響。（3）培養(yǎng)溫度的確定。分別將培養(yǎng)溫度調(diào)整為25℃、28℃、30℃、34℃、37℃，其他條件不變，比較溫度對菌株UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響。（4）接種量的確定。分別將種子液按8%、10%、12%、15%、18%種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察接種量對菌株UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響。（5）種齡對菌株UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響。分別將培養(yǎng)25、30、35、40、45、50 h的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察種齡對菌株UL 100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響。（6）發(fā)酵周期的確定。以上述的優(yōu)化培養(yǎng)條件培養(yǎng)菌株UL 100 80 ，從第9 d開始定時取樣，連續(xù)培養(yǎng)15 d，檢測其灰黃霉素的效價，以確定其發(fā)酵周期。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線與氯化鋰復合誘變

以紫外線照射時間為橫坐標，致死率為縱坐標，制作復合誘變致死曲線。如圖1所示，致死率與紫外的照射時間成正相關(guān)，照射時間達180 s，其致死率可達97.5%。

本試驗采用紫外線與氯化鋰復合對 ji 2 進行處理，紫外線誘變100 s時，致死率為81.4%，篩選出高產(chǎn)菌株UL 100 32 、UL 100 80 、UL 100 46 、UL 100 2 、UL 100 89 ，分別測定突變菌株產(chǎn)灰黃霉素的效價，結(jié)果如表1所示，UL 100 80 效價為 91 304 μg·mL-1 ，比 ji 2 提高了47.8%，菌株UL 100 46 的效價僅次于菌株UL100 80，效價比出發(fā)菌株提高了32.3%。

2.2 突變株穩(wěn)定性遺傳分析

將篩選的高產(chǎn)菌株UL100 32、UL100 80、UL100 46、UL100 2、UL100 89連續(xù)傳代，檢測效價，以第1代效價為參考，按照相對效價來衡量突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如表2所示。遺傳穩(wěn)定性較好的高產(chǎn)菌株有UL100 80、 UL100? 32、UL100 2、UL100 89，可作為下一步試驗菌株，UL100 46穩(wěn)定性較差，第2代效價就下降到71.6%，不適合做下一步的試驗菌株。

2.3 突變菌株的發(fā)芽率

對突變株UL100 80、UL100 32、UL100 2、UL100 89進行孢子培養(yǎng)，觀察其18、30 h的生長情況，結(jié)果如圖2、3所示，菌株UL100 80在18 h其發(fā)芽率、一級菌絲率均高于出發(fā)菌株 ji 2 ，測定的第10 d效價，菌株UL100 80的效價為 91 304 μg·mL-1 ，比出發(fā)菌株ji 2提高了47.8%，可見，UL100 80在較短周期內(nèi)效價較高，符合目標菌株的特點。

2.4 菌株UL100 80的培養(yǎng)優(yōu)化

2.4.1 碳源對菌株UL100 80產(chǎn)灰黃霉素的影響 以等量的大米粉、燕麥粉、玉米渣、小米粉、小麥粉、麩皮粉分別作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，研究碳源對菌株?UL100 80 產(chǎn)灰黃霉素的影響，結(jié)果如圖4，以大米粉為碳源的效價高于其他碳源，故選擇大米粉為碳源進行后續(xù)試驗。