CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動(dòng)物疾病模型構(gòu)建的應(yīng)用

冷燁

（北京王府學(xué)校 102209）

基因編輯技術(shù)是當(dāng)下研究基因功能的最主要方法，也是后基因組時(shí)代的研究?jī)?nèi)容與熱門(mén)話題[1]。 這種技術(shù)產(chǎn)生于20 世紀(jì)80 年代，使用自然狀態(tài)下同源重組對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)的敲除或替換[2]。 但由于基因編輯技術(shù)成本比較高，消耗的時(shí)間很長(zhǎng)，極大影響了基因編輯技術(shù)的發(fā)展[3]。 直到現(xiàn)在，大多數(shù)研究也是使用同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)基因打靶。 不過(guò)隨著科技水平不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出3 種不同的基因編輯技術(shù)，分別是鋅指核酸酶技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)。 3者互相比較，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以在大部分細(xì)胞和個(gè)體種進(jìn)行基因編輯，并且可以精準(zhǔn)打靶及修飾[4]。 其實(shí)驗(yàn)周期比較短，更加利于觀察。 本文主要綜述了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的適應(yīng)性機(jī)制和它在基因編輯領(lǐng)域的作用及在疾病模型構(gòu)建方面的貢獻(xiàn)。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介

1987 年日本Nakata 研究組在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的特殊DNA序列。 2002 年Jansen 等把帶有回文結(jié)構(gòu)的序列稱之為CRISPR序列[5]。 由于現(xiàn)代科學(xué)對(duì)基因編輯技術(shù)的要求不斷提高，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。 與傳統(tǒng)電子數(shù)據(jù)交換方法相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)操作更加簡(jiǎn)單，效率更高。 這種系統(tǒng)有3 大類型，其中I 型和Ⅲ型需要多種蛋白才能形成切割鏈，但 II 型只需一種。 相比之下，II 型的性能更好。 所以 II 型CRISPR/Cas 的基因打靶系統(tǒng)運(yùn)用得更加廣泛，并且這種系統(tǒng)內(nèi)部所包含的Cas9 具有核酸內(nèi)切酶的活性及crRNA 和tracrRNA。另外，這種系統(tǒng)是通過(guò)同向重復(fù)的序列和間隔組成。 其中重復(fù)序列長(zhǎng)度為21～48bp，間隔的序列長(zhǎng)度和細(xì)菌種類與CRISPR的具體位置有關(guān)，一般的長(zhǎng)度為26～72bp。 其引導(dǎo)產(chǎn)生的cr-RNA 與tracrRNA 會(huì)進(jìn)行合并，同時(shí)也會(huì)引導(dǎo)RNA。 這種設(shè)計(jì)最大優(yōu)化了Cas9 蛋白對(duì)于特定DNA 體外定點(diǎn)的切割，通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)導(dǎo)入的基因編輯，其中sgRNA 會(huì)對(duì)基因組中的靶向序列進(jìn)行匹配，所產(chǎn)生用來(lái)剪切基因組的酶會(huì)在基因組中產(chǎn)生一個(gè)雙鏈切口。 細(xì)胞內(nèi)部也存在非同源末端連接和源重組這2 種修復(fù)方法，因此，目標(biāo)基因組可以進(jìn)行任意的組合排序。 在確立CRISPR/Cas9 系統(tǒng)后，人們便開(kāi)始將其用于醫(yī)療研究及動(dòng)物研究，尤其表現(xiàn)在醫(yī)療中的建立疾病模型等方面。 目前看來(lái)，這種基因編輯技術(shù)已經(jīng)足夠成熟，運(yùn)用于各個(gè)領(lǐng)域。

CRISPR/Cas9 不僅可以作為基因編輯工具，還可以通過(guò)創(chuàng)建目標(biāo)實(shí)現(xiàn)有效的基因組編輯，當(dāng)然，也有其他方面的作用。它除了在基因編輯領(lǐng)域有貢獻(xiàn)外，在內(nèi)源基因表達(dá)和調(diào)控上也發(fā)揮極大作用。 幾乎每一個(gè)生物體的細(xì)胞都有相同的DNA 序列，所以，使用這種系統(tǒng)進(jìn)行編輯非常高效。 但細(xì)胞分化會(huì)產(chǎn)生不同的有機(jī)體。 這個(gè)成就主要是因?yàn)槿旧|(zhì)的獲取。 表面看來(lái)，基因組記錄了DNA 和蛋白的化學(xué)變化基因組重編程和表觀基因組編輯，是基因組編輯的一個(gè)分支，目的是在不改變基因組序列的情況下對(duì)染色質(zhì)標(biāo)記和基因表達(dá)進(jìn)行針對(duì)性的改變。 為了編輯具有高度空間和時(shí)間特異性的表觀基因組，基因組編輯技術(shù)其實(shí)是一種新的方法，它可以實(shí)現(xiàn)持久的基因調(diào)控，在基礎(chǔ)研究和分子醫(yī)學(xué)中有很大的發(fā)展空間。 此外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以用于染色體位點(diǎn)的活細(xì)胞標(biāo)記，這對(duì)于染色體的可視化起到很大幫助。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動(dòng)物疾病模型構(gòu)建的應(yīng)用

CRISPR 基因編輯技術(shù)在疾病模型建立上有很大作用。2014 年研究人員第一次通過(guò)尾靜脈注射CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)入到成年小鼠肝臟，破壞了p53 和PTEN 兩個(gè)重要的抑癌基因，由此構(gòu)建了小鼠肝臟腫瘤模型。 該模型與傳統(tǒng)的基因打靶方法構(gòu)建的腫瘤模型有很像的外形，但相比之下CRISPR 成本更低，速度更快。 另外，在尾靜脈注射帶有規(guī)定靶點(diǎn)的CRISPR 系統(tǒng)的同時(shí)，也注射了同源臂模板序列，由此實(shí)現(xiàn)小鼠肝臟組織中非常重要的癌基因點(diǎn)突變，更加體現(xiàn)出這種系統(tǒng)編輯的準(zhǔn)確性。所以，科學(xué)技術(shù)開(kāi)始致力于CRISPR 系統(tǒng)的研究并已實(shí)現(xiàn)大腦和肺部基因組編輯，由此構(gòu)建更多的疾病模型。 同時(shí)我們也了解到，使用小鼠癌變疾病模型可以更加直觀準(zhǔn)確的觀察表型和病毒機(jī)制。 也有學(xué)者同樣利用慢病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)小鼠造血干細(xì)胞的基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯，由此又構(gòu)建出小鼠急性骨髓白血病細(xì)胞模型。 部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)這個(gè)技術(shù)可以用于人類，于是就將CRISPR/Cas9 技術(shù)運(yùn)用于人腸道癌變器官上的研究，然后進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)與觀察，并且發(fā)現(xiàn)其中有5 種不同的癌變器官模型。 此研究表明通過(guò)激活其通路突變可以在腫瘤微環(huán)境下維持腫瘤干細(xì)胞的特性與生長(zhǎng)。

一直以來(lái)，我科學(xué)家的實(shí)驗(yàn)對(duì)象主要是小鼠，但小鼠壽命太短，生理功能及各方面與人類還存在較大差異，即使是與人類具有同樣的遺傳缺陷，小鼠也無(wú)法完整的模擬人類疾病特征。 同時(shí)，小鼠模型不能對(duì)疾病情況進(jìn)行長(zhǎng)期追蹤，極大限制了研究進(jìn)度，于是科學(xué)家就開(kāi)始選用豬作為科研實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 因?yàn)樨i不僅自身有重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價(jià)值，其繁殖性能也很好，器官大小和生理代謝過(guò)程及解剖結(jié)構(gòu)與人類很接近，尤其是心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。 使它在生物醫(yī)藥方面具重要用途。 2014 年Hai 把Cas9mRNA 和sgRNA 注入受精卵的卵胞質(zhì)，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了vWF 基因敲除豬，制備了血管性血友病基因編輯豬模型。2015 年Zhou 和Wang 等通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)研究成功獲得了酪氨酸酶基因敲除豬、PARK2/PINK1 雙基因敲除豬和及PARKIN/DJ-1/PINK1 三基因敲除豬，由此構(gòu)建了白化病和帕金森病的動(dòng)物疾病模型。 2016 年kang 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了RUNX3 和IL2RG 敲除豬，通過(guò)RUNX3 敲除豬的研究完美構(gòu)建了人類胃癌模型。 另外，IL2GR 敲除豬是一種免疫缺陷豬，這種豬的誕生為再生醫(yī)學(xué)和異種移植的研究有不可或缺的作用。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

眾所周知，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)確實(shí)在生物基因編輯構(gòu)建和定點(diǎn)修飾上起重要作用，科研專家把這種技術(shù)運(yùn)用于疾病模型構(gòu)建及研究遺傳變異等方面，同時(shí)也體現(xiàn)出這一技術(shù)的巨大潛力。 2013 年這種系統(tǒng)的出現(xiàn)，基因編輯就成為熱門(mén)話題。 也正是由于這種技術(shù)的興起，使我們的科研隊(duì)伍能更加簡(jiǎn)單運(yùn)用并取得突破性成果。 CRISPR 系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因定點(diǎn)打靶及多重基因編輯。 雖然這項(xiàng)技術(shù)為科研提供了許多方便，但其中也存在有一些不足。 如基因治療方面還不夠完善，需要進(jìn)一步優(yōu)化開(kāi)發(fā)利用。 就目前來(lái)說(shuō)，這種系統(tǒng)已能實(shí)現(xiàn)由2～3 個(gè)基因位點(diǎn)編輯基因，但如果讓其定位更多的基因位點(diǎn)會(huì)不會(huì)造成脫靶效應(yīng)還需要進(jìn)行深入研究。 盡管如此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)仍然是一種前景無(wú)量的基因編輯技術(shù)。 這種系統(tǒng)相比其他方式更加劃算，在實(shí)際運(yùn)用中更能凸顯其優(yōu)勢(shì)。 當(dāng)下，科研專家正著手研究CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在人類疾病模型的構(gòu)建。