基于UPC2-DAD 對大黃藥材中蒽醌類化合物的快速檢測

李曉蓉，蔡 偉，張 淼，周小平，4，黃 錚，徐美蓉，李 婷，王 波，4

（1.甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所（農業質量標準與檢測技術研究所），甘肅蘭州 730020；2.甘肅省農業職業技術學院，甘肅蘭州 730010；3.禮縣春天藥業有限責任公司，甘肅隴南 742200；4.蘭州海關技術中心，甘肅 蘭州 730010）

超臨界流體（SCF） 作為流動相已有50 年的歷史[1-2]。相對于傳統的RP-LC，SCF 具有較低的黏度、較高的擴散系數，以及在較高的流速下具有較小的壓力降，而且SCF 同樣適用于熱不穩定的化合物[3-5]。超高效合相色譜（UPC2） 是傳統HPLC 和SFC 技術的結合，相對于傳統SFC 重復性差的缺點，UPC2能夠精確調節系統的壓力、溫度及流速的穩定性，從而獲得較好的重現性。此外，UPC2在分離過程中不僅具有很高的柱效，且分析速度快、靈敏度高、有機溶劑使用量少[6-8]。

大黃為常見的臨床中藥之一，源自蓼科植物大黃屬干燥根、根莖，以大黃素等蒽醌類化合物為主要有效成分，發揮導瀉、解毒、化瘀、活血等作用[9]。大黃中蒽醌類化合物的主流分離方法包括液相色譜法[10-12]和串聯質譜法[13-14]，然而這些方法具有較長的分離時間（＞30 min），目標物分離也僅限于簡單的方法學考查，并未通過研究目標物的保留行為對后續的同類研究起到指導作用；或僅對目標物的標準物質（對照品） 進行保留行為的研究，而未應用到實際樣品檢測中。

鑒于上述問題，首次基于UPC2 技術對不同分離參數（助溶劑、pH 值、洗脫梯度、動態背壓和溫度等） 下蒽醌類化合物的分離度、拖尾因子和保留時間的變化規律研究其保留行為，并應用到實際大黃樣品的檢測，最終為UPC2技術應用到天然產物分離分析提供技術支撐，同時為中藥的超快速分離提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPC2型超高效合相色譜儀，美國Waters 公司產品；配有二元溶劑輸送泵、自動進樣裝置、柱溫箱和背壓調節器；3K30 型冷凍離心機，美國SIGMA 產品；MS3 型渦旋儀，德國IKA 產品；100～1 000 μL以及1.0～5.0 mL 移液槍，美國Thermo 產品。

大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酚，Dr.Ehrenstorfer 公司提供， （純度≥98.5%）；CO2（純度≥99.997%）；甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷，均為色譜純。其余試劑均為分析純。

6 份大黃樣品，在陰涼通風處保存，待用。

蒽醌類化合物結構信息見表1。

表1 蒽醌類化合物結構信息

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將藥材粉碎后過60 目篩，精密稱取1.00 g 放入50 mL 聚乙烯管中，加入30 mL 甲醇，稱質量，超聲處理20 min 后取出放置至室溫，甲醇補失質量，提取液用0.22 μm 有機相膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.2 配制標準溶液

定量移取質量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液，甲醇稀釋定容，最終配制成質量濃度為0.5，1.0，5.0，20.0，50.0，100.0 mg/L 的標準工作液，置于4 ℃下冷藏待用。

1.2.3 UPC2分離條件

AcquityUPC2HSSSBC18色譜柱（100 mm×1.7 mm，3.0 μm）；流速2.0 mL/min；流動相A 為CO2，B 為甲醇；梯度洗脫；背壓為11.03 MPa；進樣量為1.0 μL；色譜柱和樣品盤溫度分別為40 ℃和20 ℃，檢測波長為260 nm。

梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

2 結果與分析

2.1 蒽醌類化合物的保留行為

2.1.1 助溶劑對保留行為的影響

助溶劑的作用首先通過增加流動相的溶劑化（溶解） 能力，其次是與溶質和/或固定相起特定的作用，從而改變和/或提高溶劑的選擇性；而影響溶解度與選擇性的決定因素就是助溶劑與溶質分子間的范德華力或助溶劑與溶質間特定的分子作用力等[3]。分別考查了甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈等4 種常用的有機助溶劑對5 種蒽醌類化合物在Acquity UPC2HSS SB C18色譜柱的保留及選擇性的影響。

不同助溶劑對蒽醌類化合物的影響見圖1。

由圖1 可知，使用乙腈作為有機助溶劑時，由于乙腈缺少H+供給能力，從而減弱了固定相與大黃酸（3） 之間的分配能力，不僅使大黃酸的保留能力增強（6.0 min 內未出峰），而且改變了色譜柱的選擇性。助溶劑為異乙醇、乙醇或甲醇時，可以明顯觀察到5 種蒽醌類化合物的出峰順序未發生改變，當助溶劑為甲醇時，大黃酸（3） 與大黃素（4） 的分離度（R） 達到1.6，符合分離的要求。這說明了醇類作為H+供體助溶劑，能夠與目標物形成分子間作用力，通過這些作用力而改變色譜保留行為及色譜峰形；隨著SCF-CO2的溶解能力逐漸增強，目標物的峰形，即拖尾因子（Tailing factor，Tf）、保留時間（Retention time，tR） 和分離度（Resolution，Rs） 也會受到相應的影響。經計算得出，隨著醇類助溶劑極性的增加，蒽醌類化合物的保留時間依次減少0.07，0.19，0.21，0.36，0.58 min，這說明助溶劑對流動相的影響主要體現在自身極性的高低上，醇類助溶劑的極性越大，流動相溶劑化能力越強，洗脫能力也就越強。其次，醇類助溶劑對蒽醌類化合物的拖尾因子影響不大，其拖尾因子范圍在0.91～1.76；再者，通過分離度的比較可知，除乙醇和異丙醇作為助溶劑時大黃素（4） 與大黃酸（3） 的分離度＜1.50 外，其余均符合分離要求。由此可見，甲醇在蒽醌類化合物分離過程中是較優的助溶劑。

2.1.2 柱溫對保留行為的影響

溫度對SCF 的影響機理比較復雜，主要體現在溫度的變化對SCF 的密度、黏度、溶解度和洗脫能力的相互影響，這些因素的影響常使很多有機化合物在UPC2的分析中體現復雜的交叉行為。分別考查了柱溫在30～60 ℃下蒽醌類化合物的保留及選擇性。

不同溫度對蒽醌類化合物的影響見圖2。

由圖2 可知，溫度為30 ℃時，蒽醌類化合物達到了基線分離，且峰形較好；當色譜柱溫度為40 ℃時，大黃酸（3） 和大黃素（4） 開始有部分的重合；色譜柱溫度為50 ℃時，大黃酸（3） 和大黃素（4）幾乎完全的重合；當溫度為60 ℃時，大黃酸（3） 和大黃素（4） 完全重合；此外，與傳統的RP-LC 相反，隨著溫度的升高，蒽醌類化合物的保留時間增加。同樣，經計算不同溫度對目標物tR，Tf，Rs 的變化可以看出，溫度從30 ℃升高至60 ℃的過程中，蒽醌類化合物的保留時間分別增長了46%，47%，23%，17%，17%，由此可以推斷，溫度對蒽醌類化合物的影響與其出峰順序相關，即出峰時間越早的化合物，受到溫度的影響越大；而對于Tf 和Rs，蒽醌類化合物受溫度的影響并無規律可循，這是由于溫度的變化不僅影響流動相的黏度和溶解能力，而且在試驗優化過程中，助溶劑的加入和梯度洗脫使得系統很難處在完全超臨界狀態，所以它們之間的動力學及熱力學更為復雜，有待進一步研究。

2.1.3 背壓對保留行為的影響

就壓力而言，SCF 的密度隨著系統背壓的增加而增加，其溶解度增強，目標物的保留時間會減小。一般情況下，在試驗優化過程中，為了降低樣品分析時間，改善峰形和/或提高重現性，可以在系統壓力允許的情況下，適當增加系統背壓來優化。分別考查了系統背壓在11.03～15.16 MPa 下蒽醌類化合物的保留及選擇性。

不同背壓對蒽醌類化合物的影響見圖3。

由圖3 可知，當系統背壓為11.03～15.16 MPa時，蒽醌類化合物均達到基線分離；當系統背壓為11.03 MPa 時，基線漂移，且信號噪音較大，當背壓在13.78 MPa 以上時，基線平穩，信號噪音較?。贿@是由于背壓較低時，SCF、助溶劑及目標物之間的相互溶解能力未能達到最佳，當背壓升高時，基線和信號噪音均得到改善。為更好地了解背壓對蒽醌類化合物保留行為的影響，計算目標物的tR，Tf 和Rs等色譜參數可知，5 種蒽醌類化合物中，tR 的變化率分別為大黃酚19.0%，大黃素甲醚18.8%，大黃酸8.8%，大黃素8.7%，蘆薈大黃素7.7%，上述數據可以推斷出，化合物的保留越強，其保留時間對壓力的變化越敏感；而Tf 均在0.92～2.01，對化合物的色譜峰形影響不大。由上可知，系統背壓對于蒽醌類化合物的分離過程中并不屬于重要的參數。

2.1.4 洗脫梯度對保留行為的影響

使用UPC2對蒽醌類化合物進行分離時，相對于簡單的對照品分離，一般僅需采用等度洗脫即可完成，而對于復雜的樣品和/或結構相似的化合物，選擇梯度洗脫既能縮短分析時間，又可提高靈敏度。與傳統LC 相似，洗脫梯度的改變直接影響結構相似的同一類分析物的保留行為。試驗在80%系統最高壓力的范圍內，通過改變助溶劑的初始比例（A∶B=99∶1～94∶6，V/V） 來考查蒽醌類化合物的的分離效果。

不同洗脫梯度對蒽醌類化合物的影響見圖4。

由圖4 可知，助溶劑B 初始比例的改變對蒽醌類化合物的影響主要體現在tR 上。隨著助溶劑初始比例的增加，流動相的溶解能力、密度和超臨界狀態均隨之改變，為了更好地反映助溶劑等比例改變對蒽醌類化合物的影響程度，以5 種蒽醌類化合物在不同初始比例下的保留時間為縱坐標，助溶劑初始比例為橫坐標，制作雷達圖。

洗脫梯度對蒽醌類化合物保留時間的影響見圖5。

由圖5 可知，蒽醌類化合物在助溶劑（B） 的初始比例為1%～5%時，保留時間幾乎等比例減小，當助溶劑（B） 初始比例大于5%時，蒽醌類化合物的保留時間有著較大的改變；這種現象主要是因為隨著有機相初始比例的增加，當助溶劑的比例小于5%時，流動相仍然保持著SCF 狀態，且較小比例助溶劑的加入，流動相的溶解和/ 或洗脫能力仍以SCF為主；當助溶劑比例大于5%時，較高比例助溶劑的加入使得流動相的狀態由超臨界流體逐漸成為亞臨界流體，其分離機理表現為更復雜的混合洗脫模式；有文獻指出，當助溶劑比例達35%以上時，流動相的洗脫能力以有機相溶劑為主，表現出較為典型的正相或反相洗脫模式，而超臨界流體所發揮的洗脫和/保留能力大幅度減弱[1]；故在UPC2的方法優化中，可通過增加與目標物相對應的階段性洗脫梯度的有機相比例來實現分離優化。

2.2 方法學考查

2.2.1 專屬性

對樣品進行處理后，分別量取5 種蒽醌類混合標準工作液溶液和樣品溶液適量，經色譜進樣分析，樣品中雜質成分與5 種蒽醌類化合物的色譜峰均分離良好，該方法具有良好的專屬性。

2.2.2 精密度

精密量取高、中、低3 種質量濃度的混合標準工作液溶液，最優色譜條件下測定蒽醌類化合物的日內和日間精密度。通過計算5 種蒽醌類化合物的含量，得到5 種蒽醌類化合物含量的日內精密度（RSD） 范圍為1.8%～3.5%，日間精密度（RSD） 分別為0.9%～1.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 方法重復性

取同一批大黃樣品，將其平均分為6 份，對樣品進行處理，色譜分析，計算RSD 值。5 種蒽醌類化合物在大黃樣品中均有檢出，平均含量分別為大黃酚456.38 mg/kg，大黃素甲醚112.01 mg/kg，大黃酸771.38 mg/kg，大黃素226.90 mg/kg，蘆薈大黃素125.88 mg/kg，RSD 范圍為3.39%～10.65%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 樣品穩定性

取同一批大黃樣品，平均分為3 份，對樣品進行處理，處理后的溶液密封后，于室溫下自然放置，分別于0，2，4，8，12，24 h 后取出該溶液1.0 mL，按1.2.3 中色譜條件對樣品進行分析，以5 種蒽醌類化合物的含量為指標，最終其含量的RSD 范圍為3.93%～7.34%，表明樣品提取液在室溫下24 h 內穩定。

2.2.5 線性范圍及檢出限

對混合標準工作液進行分析，每個質量濃度點進樣3 次，以平均峰面積值A 為縱坐標，質量濃度C（mg/L） 為橫坐標，繪制標準曲線。以S/N=3 和S/N=10 分別確定其檢出限和定量限。

蒽醌類化合物的線性范圍、檢出限及定量限見表3。

由表3 可知，5 種蒽醌類化合物的檢出限及定量限除大黃酸分別為0.50，1.00 mg/kg，線性范圍在1.00～100.00 mg/kg 外；其余蒽醌類化合物分別為0.25 mg/kg 和0.50 mg/kg，線性范圍RSD 范圍在0.50%～100%，能夠滿足實際樣品檢測的要求。

2.2.6 加標回收率

取已知含量的同一批大黃樣品6 份，分別加入高、中、低3 種不同質量濃度的混合標準工作液，經前處理及色譜分析后，計算5 種蒽醌類化合物的加標回收率。目標化合物的加標回收率范圍為89.94%～112.84%，RSD 為1.3%～8.4%，表明所建立的方法具有較好的準確度，可以滿足后續試驗要求。

2.3 樣品的測定

取所收集的大黃樣品，準確稱取1.00 g，按1.2.1方法進行樣品處理，按1.2.3 中所述的色譜條件進樣分析，每個樣品重復進樣3 次，計算大黃中5 種蒽醌類化合物的含量。

樣品中5 種蒽醌類化合物的含量見表4；大黃樣品UPC2色譜圖見圖6。

由圖6 可知，因其保留行為與傳統LC 不同，樣品分離過程中5 種蒽醌類化合物峰形對稱，與樣品中的雜質分離良好，并在1.6 min 內即完成了分離，分離速度是傳統LC 的5～10 倍。此外，由表9可知，6 種大黃樣品中5 種蒽醌類化合物的含量分別為大黃酚235.42～586.37 mg/kg，大黃素甲醚99.58～158.21 mg/kg，大 黃 酸902.67～539.14 mg/kg，大黃素102.98～236.29 mg/kg，蘆薈大黃素87.26～157.49 mg/kg。其測定結果與文獻[15]結果一致，由此可以看出，UPC2在中藥和/或天然產物分離中不僅分析速度快、環境友好，且能夠作為傳統LC 分析范圍的補充，甚至延伸，為中藥和/或天然產物分析提供新思路。

表4 樣品中5 種蒽醌類化合物的含量 / mg·kg-1

3 結論

首次采用UPC2同時測定了大黃中的5 種蒽醌類化合物成分。通過蒽醌類化合物的保留行為可以得出，對于蒽醌類化合物，初始梯度的改變并不能顯著改善選擇性及色譜峰形；通過改變背壓或者色譜柱溫度有利于調節分析時間，但溫度和背壓相互影響、相互制約；甲醇相對于其他有機溶劑具有較強的洗脫能力，且對于蒽醌類化合物而言具有較好的選擇性及色譜峰形。通過方法學考查，表明該方法靈敏度高，重現性、穩定性良好，檢測時間短，完成一次實際樣品分析僅4.0 min，與文獻相比，分析速度比傳統LC 快近5～10 倍，可用于大黃中蒽醌類成分含量的快速測定，為大黃質量控制提供參考和技術支持，并可以與傳統LC 在中藥和/或天然產物檢測方法上進行互補。