健婦膠囊中阿魏酸含量測定方法的改進

朱玉芳 劉瀟瀟

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663

健婦膠囊由海狗腎、鹿胎、山茱萸、酒當歸、炒白術等11 味藥組成，具有補血養血，活血化瘀，調經止帶的功效，臨床常用于治療赤白帶下、血崩血漏、宮冷不孕、月經不調[1]。酒當歸活血通經，為本方中主要藥味之一，主含阿魏酸、揮發油、維生素B12、葉酸等成分[2-5]。健婦膠囊現行標準中酒當歸含量測定方法操作繁雜，結果重現性差，提取效率低。為了更加有效地控制產品質量，確保療效，本研究從化合物的性質和規律入手，對原提取方法進行改進，建立HPLC法測定健婦膠囊中阿魏酸的含量，為健婦膠囊質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀(島津公司)；Sartorius CP244S/CP225D電子天平(德國Sartorius公司)；Thermo Fisher D低溫離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；Elmasonic S 300H超聲儀(德國Elma公司)；Milli-Q超純水制備儀( 美國Millipore 公司) 。

1.2 試藥 阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，含量以99.0%計)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純；健婦膠囊(批號：130801、131001、131201、141101、141102、141103、160401、160402、160403)，缺當歸陰性樣品由實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為 SHARPSIL -H C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-1%醋酸溶液(35∶65)，檢測波長為322 nm，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含阿魏酸20μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內容物，混勻，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%碳酸鈉溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率350 W，頻率37kHz)20分鐘，放冷，再稱定重量，用5%碳酸鈉溶液補足減失的重量，搖勻，離心(轉速為每分鐘5000轉)8 min，精密吸取上清液25 mL，用乙醚洗滌2次，每次25 mL，棄去乙醚液，水溶液用鹽酸調節pH值至1～2，用乙醚振搖提取5次，每次25 mL，合并乙醚提取液，低溫水浴揮干乙醚，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺當歸陰性對照樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，分別按“2.1”項下條件測定，記錄色譜圖，在與對照品色譜峰相應的位置上，供試品溶液顯示對應的色譜峰，陰性對照溶液無對應色譜峰。結果表明，陰性溶液對檢測結果無干擾。如圖1所示。

2.6 線性關系考察 精密稱取阿魏酸對照品0.01210 g(十萬分之一天平稱取)，加甲醇制成每1 mL中含阿魏酸19.1664 μg的對照品溶液，分別精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項下條件測定，以峰面積Y為縱坐標，對照品進樣量X為橫坐標，其回歸方程為：Y=7.3E+6X-3773.0(r=1.0000)，阿魏酸在0.02～0.48 μg范圍內，進樣量與峰面積之間呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精密吸取濃度為19.1664 μg/mL的阿魏酸對照品溶液10 μL，按“2.1”項下條件連續進樣6次，測得阿魏酸峰面積的RSD=0.1%，表明進樣精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于1、4、8、12、16、20、24 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測得樣品中阿魏酸峰面積的RSD=0.2%。說明樣品中阿魏酸在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗 取健婦膠囊樣品(批號：160401)6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，結果RSD為0.8%，表明分析方法重復性良好。

2.10 回收率試驗 取已知阿魏酸含量的樣品(批號：160401)6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入濃度為17.9685 μg/mL的對照品溶液5 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，平均回收率為91.3%，RSD為1.3%，表明該方法可行。結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.11 樣品的含量測定 取健婦膠囊樣品九批，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下條件測定，計算阿魏酸的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取阿魏酸對照品溶液在210～400 nm波長范圍內掃描，結果在波長為322 nm處有最大吸收，故以322 nm作為阿魏酸的檢測波長。如圖2所示。

3.2 提取溶劑的選擇 阿魏酸化學名為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸(Ferulic acid)，是一種芳香酸，在植物體內很少以游離態存在，主要與低聚糖、多胺、脂類和多糖形成結合態。根據阿魏酸的理化性質，采用堿解法可以水解出游離態的阿魏酸，故選取5%碳酸鈉提取結合乙醚萃取以增加阿魏酸的提取率。取3批樣品(批號：160403、160402、160401)，分別按原方法和新建立的方法對酒當歸中的阿魏酸進行測定，結果表明，采用新建立的方法測定健婦膠囊中阿魏酸的含量結果約為按照原測定結果的3倍，可見原方法對樣品中阿魏酸提取不完全，其原因是原方法標準采用乙醚作為提取溶劑，僅檢測出游離態的阿魏酸，提取效率低。采用5%碳酸鈉溶液提取，能水解結合態的阿魏酸，提取效率高，能更好地對健婦膠囊中的酒當歸進行質量控制。見表3。

3.3 含酒當歸中成藥的質量控制 《中國藥典》2015年版一部收載含酒當歸的中成藥品種中，有8個(小金丸/片/膠囊、中風回春丸/片、當歸龍薈丸、固本益腸片、參茸白鳳丸、參茸固本片、獨活寄生丸、豨薟通栓丸/膠囊)均采用薄層色譜法對其中酒當歸進行檢測，其前處理方法中，中風回春丸/片采用加氨水提取，其他品種均采用直接用乙醚提取。鑒于薄層色譜鑒別不需進行回收率考察，故采用乙醚提取即可。據文獻報道[6-10]，采用高效液相色譜法對中成藥中酒當歸進行阿魏酸含量測定，其前處理方法大多采用加堿溶液進行提取，以保證提取完全，回收率符合藥典規定。因此，對于中成藥中酒當歸的質量控制，可視處方組成、處方量及制法采用適宜的檢測方法，進而確定科學簡捷的前處理方法。

表3 兩種不同方法的樣品測定結果

3.4 結論 酒當歸能活血通經，當歸經過酒炙，活血作用增強，是健婦膠囊處方中重要藥味之一。健婦膠囊現行標準為進口藥品注冊標準JZ20020011，為2000年前研發，已不符合實際需要，因此，需要優化酒當歸中阿魏酸的含量測定方法。本實驗所建立的阿魏酸測定方法較原方法提取效率高了3倍，操作更加簡便，準確，重復性好，可用于健婦膠囊中阿魏酸的含量測定，為中成藥中酒當歸的質量控制提供依據。