TGF-β1通過ERK1/2通路上調人肝星狀細胞程序性死亡配體1的表達

李培培，鮑士祥，金 帥，常 偉，路景濤,，魏 偉

(安徽醫科大學1. 臨床藥理研究所、2. 生命科學學院，安徽 合肥 230032)

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝臟主要的間質細胞之一，在肝纖維化和肝癌的發生、發展中起了重要作用。正常時HSCs作為儲脂質細胞占肝臟細胞總數8%～13%，主要參與體內維生素A、膠原等基質的代謝。靜止狀態的HSCs，不表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，具有低增殖活性，低合成膠原能力。肝損傷時，在肝炎病毒或細胞因子作用下，靜止的HSCs被激活，脂質消失，表達α-SMA，發生形態學改變，轉化為激活的HSCs(aHSCs)。HSCs激活是肝纖維化形成并發展為肝癌核心環節[1]，aHSCs在“肝炎-肝纖維化/肝硬化-肝癌”肝癌發生過程中發揮重要的作用。文獻報道，aHSCs可增加腫瘤組織中骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)，從而促進肝癌的發展[2]。aHSCs通過免疫調節作用，可抑制T細胞反應、誘導T細胞凋亡、減弱T細胞對腫瘤細胞的殺傷[3]。

B7家族抑制性分子程序性死亡配體1(programmed death ligand-1，PD-L1)是近來發現的B7超家族I 型跨膜糖蛋白，在促進活化T細胞凋亡和抑制活化的T細胞增殖等方面有重要的作用。PD-L1表達在多種免疫細胞和外周組織，如內皮細胞、肝細胞、肝星狀細胞和多數腫瘤細胞中[4]。程序性死亡因子1(programmed death factor 1，PD-1)是屬于CD28/CTLA-4家族的PD-L1的受體，主要表達在T細胞表面。PD-L1與PD-1結合后能產生負性調節作用，導致T細胞反應下降，誘導T細胞凋亡，減弱T細胞對腫瘤殺傷，促進腫瘤發生、發展[5]。PD-L1的表達與多種腫瘤的進一步發展和預后復發有關，因此PD-L1臨床應用價值可作為腫瘤預后的指標。文獻報道PD-L1在aHSCs表面高表達，參與aHSCs的免疫調節，誘導肝癌免疫耐受，促進肝癌發生、發展[6]。

轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種細胞因子，在肝癌微環境中的大量存在，可調節細胞分化和生長，抑制免疫功能，促進肝癌發生與發展[7]。大量研究表明，TGF-β1作為HSCs活化中的關鍵因子，可促進HSCs增殖，影響HSCs分泌的細胞因子，促進肝癌發展[8]。但TGF-β1能否通過上調HSCs表面PD-L1的表達，抑制免疫功能，促進肝癌發生與發展，未見文獻報道。本文研究了TGF-β1對HSCs表面PD-L1表達的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肝星狀細胞系LX-2，購于中南大學湘雅醫學院。

1.1.2主要試劑 重組人TGF-β1(批號0611209-1)購于美國Peprotech公司；PD-L1抗體(批號13684S)、ERK1/2單克隆抗體(批號4695)、p- ERK1/2單克隆抗體(批號9101)購于美國CST公司；PE標記的PD-L1流式抗體(批號329706)購于美國Biolegend公司；U0126(批號U120)購于美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養液購于加拿大WISENT公司；聚偏氟乙烯微孔轉移膜(PVDF)購于美國Millipore公司；ECL化學發光顯影試劑盒購于美國 Thermo 公司。

1.1.3主要實驗儀器 FC500 流式細胞儀：Beckman Coulter 公司；CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus光學工業株式會社；CO2培養箱：美國Thermo Fisher Scientific;WB顯影儀：美國Thermo Scientific。CP225D電子分析天平: 德國Sartorius儀器公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1TGF-β1刺激LX-2細胞 取對數生長期的LX-2，0.25% 的胰酶消化，細胞計數，將1×109個·L-1細胞接種于6孔板，毎孔1 mL，5% CO2，37 ℃培養；4 h后棄培養液，加入含有TGF-β1(0、5、10、20 μg·L-1)的培養基培養。

1.2.2流式細胞術檢測PD-L1 TGF-β1(5、10、20 μg·L-1)刺激48 h或TGF-β1(10 μg·L-1)刺激24，48，72 h后，0.25% 的胰酶消化LX-2細胞，輕輕吹打分散后，加入到離心管中，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清；PBS洗滌2次，加入流式管中，每管100 μL細胞懸液；將PD-L1抗體按抗體說明書，用PBS稀釋成適當比例，加入流式管，輕輕震蕩混勻，室溫避光孵育30 min；補加300 μL PBS，流式細胞儀檢測細胞熒光強度；數據采用FlowJo 軟件進行分析。

1.2.3Western blot檢測LX-2細胞PD-L1、ERK1/2和p-ERK1/2表達 TGF-β1(0、5、10、20 μg·L-1)或TGF-β1 (10 μg·L-1)加 U0126 (5 μmol·L-1) 刺激48 h后，棄上清，4 ℃預冷的PBS洗滌2次。棄PBS后，將細胞置于冰上，100 μL裂解液冰上裂解30 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清；蛋白定量，煮沸10 min，-20 ℃保存備用。上樣，110V電泳1 h，200 mA電流轉移2 h；PVDF膜放入0.05% Tween-20的PBS(PBST)中37 ℃封閉2 h；加PD-L1(1 ∶500)、ERK1/2(1 ∶500)、p-ERK1/2(1 ∶500)、β-actin(1 ∶1 000)一抗4℃孵育過夜；PBST洗10 min ×3次；加入羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，凝膠成像系統掃描，Image-Pro Plus軟件分析。

2 結果

2.1 TGF-β1上調LX-2 細胞表面PD-L1的表達流式結果顯示，與對照組相比，不同濃度的5、10、20 μg·L-1TGF-β1刺激LX-2細胞48 h后，明顯增加了LX-2細胞表面的PD-L1表達(Fig 1A，1B)。同時，10 μg·L-1TGF-β1刺激LX-2細胞 24、48、72 h，時間依賴性增加了細胞表面PD-L1的表達水平(Fig 1C，1D)。

2.2 TGF-β1增加LX-2細胞p-ERK1/2的表達Western blot結果顯示，與對照組相比，10、20 μg·L-1TGF-β1明顯增加LX-2細胞中p-ERK1/2的表達(P<0.01或P<0.05)，但5、10、20μg·L-1TGF-β1對ERK1/2的表達沒有明顯影響(Fig 2A)。10、20 μg·L-1TGF-β1明顯增加p-ERK1/2 / ERK1/2的比值。提示TGF-β1上調LX-2細胞表面PD-L1的表達可能與ERK1/2通路有關。

2.3 U0126下調TGF-β1誘導的LX-2細胞表面PD-L1的表達以上結果表明TGF-β1上調LX-2細胞表面PD-L1的表達可能與ERK1/2通路有關，為了進一步確定TGF-β1上調LX-2細胞表面PD-L1的表達與ERK1/2通路上調有關，TGF-β1刺激LX-2細胞，加入ERK1/2通路特異性阻斷劑U0126，流式細胞術及Western blot檢測PD-L1表達，Western blot檢測p-ERK1/2和ERK1/2的表達。結果顯示，TGF-β1增加LX-2表面PD-L1和p-ERK1/2的表達(P<0.01)，U0126能夠下調TGF-β1上調的LX-2細胞表面PD-L1和p-ERK1/2的表達(P<0.01，P<0.05)(Fig 3A-3F)。提示TGF-β1通過ERK1/2通路上調LX-2細胞表面PD-L1的表達。

3 討論

肝星狀細胞、淋巴細胞、上皮細胞、細胞因子、肝癌細胞等構成HCC微環境，在HCC發生、發展中的發揮了重要作用。HCC組織中，肝血竇癌細胞旁、壞死灶周邊及肝癌胞膜下均可見HSCs數量明顯增多。肝癌細胞可誘導HSCs活化，同時活化的HSCs又反作用于肝癌細胞，呈級聯放大效應，形成利于肝癌生長的微環境，最終促進肝癌細胞生長、侵襲及轉移[9]。近年來文獻報道aHSCs有較強的免疫調節作用，可表達多種免疫相關分子，直接參與局部免疫調節[10]。同時，aHSCs抑制T細胞反應、減弱T細胞對腫瘤細胞的殺傷，提高腫瘤組織中Treg和MDSCs比例，從而促進腫瘤的發生發展[11]。

Fig 1 TGF-β1 up-regulated PD-L1 expression on LX-2

Fig 2 TGF-β1 increased p-ERK1/2 expression in LX-2

Fig 3 U0126 reduced PD-L1 expression in LX-2

PD-L1是近年發現的B7家族的主要新成員之一，與癌旁組織和正常組織相比，肝癌組織中PD-L1表達的水平明顯升高。PD-L1的陽性表達與癌組織分化程度、侵襲轉移相關，并成為腫瘤預后判斷新的生物學指標。文獻報道aHSCs表達的PD-L1可與活化T細胞表達的PD-1結合，抑制T細胞反應，誘導T細胞凋亡，最終誘導肝癌免疫耐受，促進肝癌發展[12]。在肝癌微環境中，TGF-β1為大量存在的細胞因子之一，TGF-β1可激活癌癥相關的纖維化細胞、HSCs細胞、腫瘤相關的巨噬細胞[13]。TGF-β1促進HSCs增殖和激活，促進肝癌發展[14]。我們前期研究發現，TGF-β1可上調DC表面PD-L1的表達，減弱T細胞對肝癌細胞的殺傷，促進肝癌的發生、發展。但TGF-β1是否能誘導HSCs上PD-L1表達，并促進肝癌的發展目前未見報道。由此我們采用流式細胞儀和Western blot方法檢測了TGF-β1對人肝星狀細胞LX-2細胞PD-L1表達的影響。結果顯示TGF-β1明顯上調LX-2細胞PD-L1的表達。接著我們考察了TGF-β1上調LX-2細胞PD-L1的表達的機制。文獻報道，TGF-β1可以通過MAPK通路促進肝纖維化的形成[15]。哺乳動物存在3種不同的MAPK通路，包括細胞外調節激酶ERK1/2通路、c-Jun氨基末端激酶JNK通路和p38 MAPK通路，其中TGF-β1主要激活HSCs上ERK1/2通路[16]。文獻同時報道誘導細胞 PD-L1表達與MEK/ERK1/2通路、PI3K/AKT通路、NK-κB、JAK/STAT 信號通路和STAT-3有關[17-18]，由此推測TGF-β1上調LX-2細胞表面PD-L1表達可能與ERK1/2和p-ERK1/2表達有關。Western blot和流式細胞術結果顯示，TGF-β1能明顯增加LX-2細胞中p-ERK1/2表達，而對ERK1/2沒有影響。推測TGF-β1增加LX-2細胞中ERK1/2磷酸化。為了進一步證明TGF-β1/ERK1/2是否參與調控LX-2細胞表面PD-L1表達，我們使用ERK1/2特異性阻斷劑U0126。流式和Western blot結果顯示，U0126阻斷LX-2細胞中ERK1/2通路后，PD-L1在LX-2細胞表面的表達明顯減少。以上結果表明TGF-β1通過ERK1/2通路上調LX-2細胞表面PD-L1的表達，本研究將為HCC的發病機制和免疫治療提供理論依據。