淫羊藿苷通過下調(diào)ATF6-DR5信號通路改善異丙腎上腺素所致小鼠左心室心肌細胞凋亡

曾凡群，李曉彤，林小英，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學藥學院，基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

心力衰竭的死亡率居高不下，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，左心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為心肌細胞凋亡、心肌細胞肥大和心肌纖維化[1-2]。其中，心肌細胞凋亡是左心室重構(gòu)的重要機制之一，參與眾多心血管疾病的病理過程[3]。此外，細胞凋亡引起心肌細胞的喪失與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，減輕心肌細胞凋亡是改善左心室重構(gòu)、預防心力衰竭的重要策略。

心肌細胞凋亡的機制十分復雜。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是心肌細胞凋亡的重要途徑之一[4]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)為ERS的標志性蛋白。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)是誘導心肌細胞凋亡經(jīng)典模型的工具藥之一，用于心臟疾病的研究[5]。研究表明[6]，ISO誘導的心肌細胞凋亡模型中，GRP78與活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)的蛋白水平明顯升高、心肌細胞凋亡增多，導致心力衰竭。當細胞受到刺激誘發(fā)ERS時，ATF6與GRP78解離后激活死亡受體5(death receptor 5，DR5)表達，促進細胞凋亡[7]。因此，抑制ATF6-DR5信號通路是減輕心肌細胞凋亡的途徑之一[7-8]。

淫羊藿苷(icariin, ICA)系小檗科淫羊藿屬(Epimediuml.)植物的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗氧化、改善高血壓心臟病等藥理作用[9]。但ICA對ISO誘導的心肌細胞凋亡的研究尚未見報道。因此，本研究采用ISO誘導的心肌細胞凋亡模型，觀察ICA是否能夠改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡，并初步探討其機制是否與下調(diào)ATF6-DR5信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1藥品 ICA(純度≥98 %，批號:FY17420615，購于江蘇省南京澤朗醫(yī)藥有限公司)；ISO(純度:>99.0%，貨號:HY-B0468，購于MCE公司)。

1.1.2試劑 NON-Fat Powdered Milk(BBI公司，Lot: F704BA0001)；Albumin Bovine V(Solarbio公司，貨號:A8020)；GRP78抗體(proteintech公司，貨號:11587-1-AP)；ATF6抗體(proteintech公司，貨號:24169-1-AP)；DR5抗體(英國Abcam公司，貨號:ab8416)；GAPDH抗體(proteintech公司，貨號:10494-1-AP)；Anti-Rabbit IgG(BBI公司，貨號:D110058-0025)；High-sig ECL Western blot Substrat(Tanon公司，貨號:180-501)；Trans-Blot Turbo 5×Transfer Buffer(美國BIO-RAD公司，貨號:#10026938)；PVDF膜(millipore公司，貨號:IPVH00010)。

1.2 儀器Supply Mini-Protean3電泳儀；Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；Olympus光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R離心機(德國Eppendorf公司)；ChemiDoc 成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；全波長酶標儀(Thermo公司)；RM2245組織切片機(德國Leica Biosystems公司)。

1.3 實驗動物6～7周齡的C57小鼠40只,許可證號:SCXK(湘)2014-0011，♂，40只C57小鼠于SPF級動物房適應性喂養(yǎng)10 d，自由飲水和進食。將其隨機均分為4組(n=10):① 正常對照組(Control組)；② ISO組；③ ICA低高劑量組(ICA-L組, ICA-H組)；除Control組外其他3組小鼠經(jīng)頸背部皮下注射ISO(5 mg·kg-1·d-1)建立心肌細胞凋亡模型[6]，連續(xù)14 d。同時，ICA-L、ICA-H組灌胃給予ICA混懸液(15,60 mg·kg-1·d-1)，ISO組給予等量雙蒸水，連續(xù)14 d。Control組頸背部皮下注射等體積生理鹽水(0.01mL·g·d-1)并灌胃等體積雙蒸水，連續(xù)14 d。

1.4 左心室質(zhì)量指數(shù)的測定末次給藥后稱量C57小鼠體質(zhì)量。迅速打開胸腔，取心臟組織，立即置于預冷的PBS溶液中灌洗后用濾紙吸干水分，然后分離左心室(含室間隔)稱左心室重量(mg)，計算左心室質(zhì)量指數(shù)(左心室重量/小鼠體重)。

1.5 左心室心肌細胞凋亡的檢測隨機切取心臟組織并置于4%中性甲醛溶液中固定，包埋，制作石蠟切片，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，蛋白激酶K(20 mg·L-1)作用10 min破膜，TUNEL混合液37 ℃孵育1.5 h，converter-POD 37 ℃孵育35 min，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1～1.5 min、蘇木精復染30 s，流水沖洗10 min，用中性樹膠封片。使用Olympus顯微鏡觀察心肌細胞的凋亡情況并拍照記錄。凋亡心肌細胞核被染成棕色，正常核染成藍色。使用ImageJ軟件計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)。細胞凋亡率為凋亡細胞數(shù)相對于細胞總數(shù)的比例。

1.6 左心室GRP78、ATF6和DR5蛋白水平的檢測于-80 ℃冰箱迅速取出冰凍心臟組織約50 mg，剪碎后放入500 μL RIPA 裂解液中，加入0.5 μL PMSF溶液，于冰上充分研磨后靜置30 min，4 ℃離心20 min(轉(zhuǎn)速:12 000 r·min-1)，用BCA法測上清液的總蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠行電泳過程，然后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜，7% Non-Fat Powdered Milk 4 ℃封閉3～4 h，一抗結(jié)合: GRP78(1 ∶5 000)、ATF6(1 ∶1 500)、DR5(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃過夜孵育；Anti-rabbit IgG結(jié)合(1 ∶5 000)2～3 h，High-sig ECL Western Blot Substrat顯色，ChemiDoc成像系統(tǒng)獲取圖像并采用Image Lab軟件進行分析。

1.7 統(tǒng)計學分析按完全隨機對照要求收集整理并統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 18.0軟件進行One-way ANOVA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法。

2 結(jié)果

2.1 左心室質(zhì)量指數(shù)的改變與Control組相比，ISO組左心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P<0.05)。與ISO組相比，給予ICA后左心室質(zhì)量指數(shù)逐漸降低，以ICA-H組差異最為明顯(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of ICA on left ventricular mass

2.2 左心室心肌細胞凋亡的變化TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，ISO組左心室心肌細胞凋亡率是8.94倍(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室心肌細胞凋亡率降低了31.1%(P<0.05)，見Fig 2。提示ICA能減輕ISO誘導的左心室心肌細胞凋亡。

2.3 左心室GRP78蛋白水平的變化Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，ISO組左心室GRP78蛋白水平增加了42.7%(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室GRP78蛋白水平減少了28.7%(P<0.05)，見Fig 3；提示ISO誘導的小鼠左心室心肌細胞凋亡存在ERS，而ICA能抑制ERS的發(fā)生。

Fig 2 Effect of ICA on cardiomyocytes apoptosis of left ventricular in C57 mice n=5)

Fig 3 Effect of ICA on GRP78 protein level in left

2.4 左心室ATF6蛋白水平的變化Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，ISO組左心室ATF6的蛋白水平增加了22.2%(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室ATF6的蛋白水平減少了22.5%(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effect of ICA on ATF6 protein level in left ventricle of C57 mice n=5)

2.5 左心室DR5蛋白水平的變化Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，ISO組左心室DR5的蛋白水平增加了17.4%(P<0.05)。與ISO組相比，ICA-H組左心室DR5的蛋白水平減少了24.4%(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 5 Effect of ICA on DR5 protein level in left ventricle of C57 n=5)

3 討論

心肌細胞凋亡的分子機制十分復雜。過度的心肌細胞凋亡促使高血壓心臟病患者從代償性左心肥厚轉(zhuǎn)為失代償性左心肥厚，導致左心室重構(gòu)，繼而誘發(fā)心力衰竭[10]。ISO誘導的心肌細胞凋亡模型是目前公認的制備心肌凋亡模型之一[5]。該模型具有操作簡單、周期短等優(yōu)點。ISO連續(xù)刺激后C57小鼠出現(xiàn)明顯的心肌細胞凋亡、ERS及炎癥浸潤[6]。在本研究中，ISO連續(xù)刺激14 d后，與Control組相比，ISO組左心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高。表明ISO導致C57小鼠左心室重構(gòu)。給予ICA干預后，與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室質(zhì)量指數(shù)明顯降低。提示ICA可減輕ISO誘導的左心室重構(gòu)。Yang等[6]研究表明，ISO誘導C57小鼠左心室心肌細胞凋亡明顯增加。本研究TUNEL染色結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組左心室心肌細胞凋亡率明顯增加。與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室心肌細胞凋亡率明顯減少；表明ICA具有改善ISO所致左心室心肌細胞凋亡作用。

GRP78屬于熱休克蛋白質(zhì)70家族的成員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白中最具代表性的蛋白之一，主要作用是促進蛋白質(zhì)正確折疊、組裝和轉(zhuǎn)運。非ERS時，GRP78與跨膜傳感器結(jié)合處于失活狀態(tài)。ERS發(fā)生早期GRP78與跨膜傳感器分離，激活未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction, UPR)恢復細胞功能，防止ERS引起的細胞損傷，若ERS持續(xù)存在，高表達的GRP78觸發(fā)細胞凋亡相關(guān)信號通路，導致細胞損傷加重甚至細胞凋亡[12]。課題組前期研究表明[11]，淫羊藿次苷Ⅱ通過下調(diào)GRP78的表達減輕ERS，改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室功能。本研究Western blot結(jié)果顯示，ISO組左心室GRP78的蛋白水平明顯升高，表明ISO激活ERS參與左心室心肌細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室GRP78的蛋白水平明顯降低。提示ICA通過抑制ERS可有效改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡。

ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜傳感器之一，與GRP78解離后處于活化狀態(tài)。研究表明，ATF6通路激活誘導心肌細胞凋亡，導致肥胖的自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生心臟重構(gòu)[13]。本研究Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組左心室ATF6的蛋白水平明顯升高。表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)下游凋亡蛋白ATF6被激活。與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室ATF6的蛋白水平明顯降低。提示ICA通過抑制左心室ATF6的表達減緩ISO所致的左心室心肌細胞凋亡。

DR5是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，因其胞質(zhì)區(qū)含死亡結(jié)構(gòu)域，通過激活死亡受體募集Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域的接頭器來誘導細胞凋亡[14]。與GRP78解離后的ATF6可直接入核促使CCAAT/增強子結(jié)合同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)的表達，過表達的CHOP通過激活DR5受體導致心肌細胞凋亡[15-16]。本研究Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，ISO組左心室DR5的蛋白水平明顯升高，說明在ISO所致的左心室心肌細胞凋亡模型中DR5蛋白被激活。與ISO組相比，ICA高劑量組(60 mg·kg-1)左心室DR5的蛋白水平明顯降低。提示ICA可能通過降低DR5的蛋白水平改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡。

綜上所述，ICA具有改善ISO所致的左心室心肌細胞凋亡作用，其機制可能與抑制ATF6-DR5信號通路有關(guān)。

(致謝:本實驗在遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室完成，感謝黃波等老師提供的幫助！)