基于生物信息學篩選紅景天苷對大鼠缺血/再灌注神經保護作用的相關基因

官喜龍，徐 靜，陳軼塵，楊 婧

(1．鷹潭市人民醫院麻醉科，江西 鷹潭 335000；2.寧波市醫學科學研究所，浙江 寧波 315000；3．浙江大學醫學院附屬第一醫院麻醉科，浙江 杭州 310002)

腦卒中是最常見的心血管疾病疾病之一，87%的中風可被歸類為缺血性腦卒中，已成為全球范圍內的嚴重健康問題[1]。目前除溶栓治療外，針對缺血性中風引起的神經功能損傷尚無有效的治療手段，因此迫切需要開發用于治療腦卒中的新型藥物，對腦卒中病理過程涉及的分子機制進行更深入的探索可能會找到對抗這種復雜疾病的新方法。紅景天苷(salidroside，Sal)是大花紅景天的主要活性成分，是一種苯丙烷類糖苷化合物，安全性高且藥理作用廣泛，包括抗氧化應激、抗疲勞、抗炎等作用[1]。近年來有研究表明紅景天苷預處理能夠明顯減少大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的梗塞面積，預防腦水腫，改善神經功能，其潛在分子機制涉及多種信號傳導途徑(如PI3K/Akt/HIF、GSK-3β/Nrf2信號通路)[2]。

微陣列技術可以快速篩選出與腦卒中相關的差異基因表達信息。結合生物信息學分析，可以分析紅景天苷預處理前后對影響腦組織缺血/再灌注的差異表達基因在腦卒中發病中的功能途徑。Lai等[3]最初在2015年的GSE52001數據集中篩選了與紅景天苷介導的神經保護作用相關的基因表達。但是該研究僅關注并研究了其中一些基因的功能。為了更全面地了解紅景天苷對抗腦缺血/再灌注損傷的發病機理，我們使用了多種生物信息學技術來重新分析GSE52001數據集中的部分數據。這項工作將提供腦卒中在分子水平上病理生理學的進一步見解，并探索新的潛在分子靶標。

1 材料與方法

1.1 微陣列數據來源和差異基因的篩選從高通量基因表達數據庫(gene expression omnibus，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載微陣列表達數據。全基因組微陣列表達譜由Agilent GPL14746平臺提供，因為經過紅景天苷預處理的大鼠缺血腦組織中Egr2、Egr4和Arc等早期基因在1h的表達上調最明顯，因此本文重點分析了缺血腦組織和經紅景天苷預處理1h的缺血腦組織的測序數據。根據原始數據的注釋信息，將探針轉換為相應的基因名。當多個探針對應同一個基因時，僅篩選具有最高平均表達水平的探針。使用R/Bioconductor Limma軟件包對每個實驗的基因表達數據進行預處理標準化。線性模型擬合后，使用貝葉斯線性模型可以識別差異基因。P<0.05和|logFC|>1作為差異基因的截止標準。分別使用R軟件包“pheatmap”和“ggplot2”進行熱圖和火山圖的可視化作圖。

1.2 差異基因的富集分析本項研究中，使用R語言對差異基因進行了的基因本體論(gene ontology，GO)富集和《京都議定書基因與基因組百科全書》(The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)相關途徑分析。另外使用R中的“clusterProfiler”包進行了基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，使用ggplot2包在R語言中進行了可視化作圖。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建和可視化以及核心基因的確定單個基因并不能調節生物學功能，蛋白質-蛋白質相互作用是細胞中生物學過程的主要參與者，使用STRING數據庫(https://string-db.org/)能夠找到的蛋白質的全面信息，用于評估蛋白質-蛋白質相互作用網絡信息。隨后，通過Cytoscape軟件(版本3.7.1)構建并可視化了PPI網絡。使用Cytoscape中的MCODE(分子復合物檢測)插件分析來篩選PPI網絡的最重要模塊。選擇標準如下：MCODE score ≥3, degree cutoff=2, node score cutoff=0.2 and max depth=100，使用Cytoscape軟件(版本3.7.1)構建了可視化網絡。

1.4 TF-DEGs-microRNA網絡構建將這些DEGs上傳到NetworkAnalysts，從ENCODE數據庫預測針對DEGs的TF，TarBase預測與DEGs相關的microRNA，最后在Cytoscape中建立TF-DEGs-microRNA網絡并將其可視化。

2 結果

2.1 差異表達基因將芯片歸一化處理后(Fig 1A)，通過R語言的Limma軟件包計算，將P<0.05和| logFC |> 1定義為差異基因的篩選標準。總共篩選出250個DEGs，包括82個上調的DEGs和168個下調的DEGs。DEGs由火山圖(Fig 1B)和熱圖(Fig 1C)展示。

2.2 差異基因的功能富集分析為了進一步研究這些差異基因的功能，通過R語言進行了GO術語和KEGG通路分析。這些差異基因均分為3個主要功能類別，即生物過程(biological processes，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞成分(cellular components，CC)。結果表明，這些差異基因主要參與類固醇代謝、激素代謝和白細胞介素1β(IL-1β)等生物學過程(Fig 2A)。在分子功能(MF)層面，主要與受體配體活性、神經遞質結合和激素活性相關(Fig 2B)。在細胞組分(CC)分析中，DEGs主要富集在細胞外基質和膠原蛋白細胞外基質(Fig 2C)。在KEGG數據庫中發現這些差異基因和神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路和PPAR信號通路密切相關(Fig 2D)。此外，我們對微陣列中的所有基因進行了GSEA分析。GSEA分析的結果表明，紅景天苷預處理在大鼠腦缺血模型中主要影響了“雌激素代謝”、“脂肪酸合成”、“IL6-JAK-STAT3信號通路”以及“干擾素γ”(Fig 3A-D)。

2.3 PPI網絡構建和關鍵模塊分析為了研究這些DEGs之間的蛋白質相互作用及其參與調控的關鍵基因。在STRING(V11.0)中構建了PPI網絡，使用軟件工具Cytoscape對網絡進行可視化，并試用 Cytoscape中MCODE進行的模塊分析，從PPI網絡中篩選出一個最重要模塊(Fig 4)，共有20個基因。 我們發現Egr2、Nr4a1、Egr1和Fos與排名前十的顯著變化的差異基因重疊。

Fig 1 Gene chip quality verification and DEGs screening

2.4 TF-DEGs-microRNA相互作用網絡挑選出共同靶向microRNA和TF的DEGs，提取其相關調控因子，并導入至然后在Cytoscape中構建與TF-microRNA相互作用的網絡(Fig 5)。我們預測到TAL1和mir-19a-3p能夠調節Nr4a1的表達。

3 討論

本項研究中，一共篩查出250個差異基因，包括包括82個上調的DEGs和168個下調的DEGs。對這些差異基因進行進一步分析，確定了紅景天苷參與腦保護作用的潛在作用分子。前10個DEGs(Egr2、Arc、Cort、Egr4、LOC689064、Nr4a1、Egr1、Sik1、Fos和Tnfaip6)被認為是紅景天苷對缺血/再灌注腦保護過程的關鍵基因。PPI網絡顯示了差異基因之間的相互作用。網絡中的關鍵節點可能是紅景天苷在缺血/再灌注的病理過程中起關鍵作用的分子。通過對PPI網絡圖中的各個節點的計算節點信息構建出最重要的聚類模塊，該模塊一共有20個差異基因組成，其中有4個與前10個差異基因相同(Egr2、Nr4a1、Egr1和Fos)。

Nr4a1 (Nur77)是類固醇甲狀腺受體家族中孤核受體NR4A亞家族中的一員。目前尚未發現其內源性配體，因此成為孤核受體。作為一個核轉錄因子，Nr4a1與許多細胞內途徑相關，如增生性疾病、代謝性疾病和癌癥等[4]。已有大量研究表明，Nr4a1參與多種疾病的病理生理過程，如腫瘤生長、炎癥反應、脂肪形成以及血管重塑等[5]。周浩等[6]發現，心臟微血管缺血/再灌注損傷后Nr4a1明顯上調，并且其水平與微血管塌陷，內皮細胞凋亡和線粒體損傷呈正相關。另一項研究表明，Nr4a1在再灌注腦組織中顯著增加，較高水平的Nr4a1能夠降低線粒體動作電位，誘發細胞氧化應激，中斷ATP生成，并啟動caspase-9依賴性細胞凋亡。并且敲除Nr4a1可減少腦梗死面積并抑制神經元凋亡[7]。另外，小膠質細胞中的Nr4a1作用于 NF-κB/p65信號通路促進中樞炎癥因子的表達，從而加劇了缺血在灌注的腦損傷[8]。以上研究結果提示，Nr4a1再組織缺血/再灌注的病理過程中的關鍵分子。大量的研究支持紅景天苷對缺血/再灌注腦保護作用[9]。已知基因的功能受上游轉錄因子和下游microRNA調控，為了進一步分析Nr4a1參與腦保護的分子機制，我們利用生物信息學技術，整合了多個數據庫，最終構建了TF-DEGs-microRNA的協同調解網絡。其中Nr4a1與TAL1和mir-425-5p存在相互調節關系。TAL1是一種轉錄因子，主要識別GATA的啟動子序列。主要在紅細胞和紅細胞相關的細胞系中表達，目前研究認為，TAL1可以促進類紅細胞向紅細胞的分化[10]。miRNA是內源性非編碼RNA，其功能是降解或抑制靶基因的翻譯過程，從而在轉錄后水平調節基因表達。已有多項研究表明，抑制mir-19a-3p可缺血性/再灌注腦損傷[11]。TAL1是否能夠調控Nr4a1的表達，Nr4a1是否為mir-19a-3p的靶基因，這部分研究內容尚處于空白狀態。因此我們的研究結果為紅景天苷在腦保護作用的研究中提供了新的思路。

Fig 2 GO enrichment analysis of DEGs and KEGG

Fig 3 GSEA analysis of all genes

Fig 4 PPI network reconstruction and key module screening

大腦缺血狀態會誘導某些早期基因的表達，本項研究發現，缺血/再灌注模型中能夠明顯調節幾種相關基因的轉錄(Egr1、Egr2、Egr4和Arc等)。有研究報道這些基因參與神經元的突觸可塑性。早期基因Arc是神經元突觸可塑性的關鍵調節因子，參與維持LTP和長期記憶的鞏固[11]，并且對突觸活性高度敏感，也可以通過突觸可塑性刺激誘導早起生長反應基因Egr家族基因的表達[12]。因此，我們的數據支持紅景天苷可以通過參與Egrs和Arc來增強缺血性腦損傷后突觸可塑性的觀點。另外一項研究結果發現，紅景天苷介導的神經保護作用與早期生長反應基因(Egrs)的誘導有關[3]，與我們的生物信息學分析一致，并支持了我們的分析結果。

為了獲得對這些差異基因的全面理解，我們使用多種生物信息學技術分析這些差異基因。GO的生物學過程主要包括類固醇代謝、激素代謝和IL-1β的產生。此外KEGG富集分析表明，這些差異基因與神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路和膽固醇代謝相關。多項研究表明，在研究腦缺血后的損傷機制和預后時，類固醇都是重要的考慮因素。臨床研究表明，由于雌激素的保護作用，男性的中風發生率顯著高于女性，且女性絕經后的中風發生率也遠高于絕經期。動物研究和臨床研究一致，在缺血/再灌注模型中，雌性成年大鼠的梗死面積遠遠小于雌性成年大鼠[13]。值得注意的是，糖尿病模型的大鼠對缺血的易感性也遠小于對照組，因為糖尿病大鼠雌激素代謝障礙，體內雌激素水平較高[14]。以上研究表明，內源性雌激素對腦卒中的保護作用。

除了雌激素，孕酮等類固醇激素也降低了女性中風的發生率。另一方面，動物研究也支持了類固醇激素的腦保護作用。孕酮治療可減少缺血性梗塞的程度并促進愈后，其潛在的分子機制包括孕酮能夠減少血腦屏障的破壞和減輕腦水腫。腦缺血后，會出現急性和長期炎癥反應，包括小膠質細胞和星形膠質細胞的早期活化，促炎性細胞因子和趨化因子的合成和釋放以及嗜中性粒細胞、T細胞和巨噬細胞向腦實質的浸潤。這一系列級聯反應加速了神經元的死亡和腦損傷的程度[15]。孕酮治療可調節小膠質細胞的密度和極化，并減少促炎性細胞因子和一氧化氮合酶產生。此外，孕酮治療還可以減少腦線粒體功能障礙，可增加神經元，少突膠質細胞及其前體的密度等[16]。以上研究表明了孕酮的腦保護作用且上述證據與KEGG分析相符。

為了驗證GO和KEGG途徑富集分析的一致性，接下來對所有基因進行了GSEA分析。分析表明，紅景天苷預處理的腦缺血模型主要影響了雌激素代謝、脂肪酸代謝和炎癥反應和干擾素通路密切相關[17]。

Fig 5 TF-DEGs-microRNA interaction network

這項研究的主要目的是鑒定與紅景天苷預處理的腦缺血模型相關的候選基因，為紅景天苷的腦保護作用提供潛在的分子靶標。通過多種生物信息學分析發現其主要通過類固醇代謝、激素代謝和炎癥因子水平等方面發揮腦保護作用。并鑒定出紅景天苷預處理對抗腦卒中的關鍵候選基因。盡管此研究中鑒定的基因在先前的研究中得到了證實，但仍需要進一步的研究來探索這些基因和途徑的具體調控機制。