活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價測定法的建立

高天紅，樸晉華 ，董培智，張志偉，王婷婷

(山西省食品藥品檢驗所，山西 太原 030031)

活血通脈膠囊為水蛭經(jīng)加工制得的膠囊劑，具有破血逐瘀、活血散瘀、通經(jīng)、通脈止痛的功效。收載于《新藥轉正標準》第十七冊，質量標準僅采用茚三酮顯色反應定性、氮測定法定量，專屬性差，且含量多少與臨床療效無關聯(lián)性，無法真正有效評價活血通脈膠囊的內在質量。水蛭是水蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全體，可破血通經(jīng)，逐瘀消癓[1]，它能減緩纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白的過程，阻止凝血酶催化的血瘀反應，抑制凝血酶與血小板結合[2]，《中國藥典》2015年版一部采用凝血酶滴定法(Markwardt 法)對其含量進行控制，但測定結果滴定體積小、影響因素多，可靠性和準確性存在不足[3]。

瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)將瓊脂凝膠為介質的沉淀反應與生物活性測定方法有機結合，以纖維蛋白原為底物，大分子物質-酶在瓊脂凝膠中擴散與底物結合成復合物，可形成特異性沉淀環(huán)，沉淀環(huán)直徑與酶的濃度相關[4]。本文基于水蛭素的生物效應，分別對Markwardt 法、瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)測定水蛭和活血通脈膠囊的生物效價進行比較研究，篩選得出經(jīng)濟、簡單、精確的水蛭素生物效價測定方法，為活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價測定法的建立，提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑牛凝血酶：中國食品藥品檢定研究院，190 BP，批號：140605-200424、140605-200426；160 BP，批號：140605-201526；牛纖維蛋白原：中國食品藥品檢定研究院，98 mg可凝蛋白，批號：140607-200736；103 mg可凝蛋白，批號：140607-201740；水蛭素標準品：中國食品藥品檢定研究院制備，效價 13 000 ATU。瓊脂糖粉：Solarbio、上海楷洋生物技術有限公司，三羥甲基氨基甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純。

1.2 藥品活血通脈膠囊：每粒裝0.25 g，山西云中制藥有限責任公司，批號：樣品1、樣品2、樣品3；水蛭(螞蟥WhitmaniapigraWhitman和柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman，清水吊干)粗粉，過三號篩，山西云中制藥有限責任公司。

1.3 試驗儀器恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科科研儀器有限公司。

1.4 供試品溶液的制備水蛭：取粉末適量，精密稱定，加 0.9%氯化鈉溶液浸提 30 min，定容。4 000 r·min-1離心 5 min，精密量取上清液并配成不同濃度的稀釋液。

活血通脈膠囊：取活血通脈膠囊內容物適量，研細，精密稱定，加 0.9% 氯化鈉溶液浸提30 min，定容。 4 000 r·min-1離心5 min，精密量上清液取并配成不同濃度的稀釋液。

1.5 不同抗凝血酶生物活性效價測定方法的考察

1.5.1Markwardt 法(凝血酶滴定法) 精密量取供試品溶液100 μL，加入含 0.5% 牛纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.4)200 μL，置水浴(37 ± 0.5 ℃)中，緩緩滴加30 000 BP·L-1凝血酶溶液至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積并計算。同時考察不同操作人員，不同時間及不同凝血酶對結果的影響。結果見Tab 1。

1.5.2瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)[5]取凝血酶標準品，用 0.9% 氯化鈉溶液制成含不同凝血酶單位的溶液。瓊脂糖加水配置成2% 的溶液。纖維蛋白原用 pH 7.5的 Tris-HCl 溶液配成 0.1% 的溶液，加入 90 ℃左右的瓊脂糖溶液(1 ∶1)，倒入培養(yǎng)皿，室溫放置 30 min打孔。取供試品溶液適量與 20 000 BP·L-1標準凝血酶溶液反應 10 min，精密量取反應后的供試品溶液及凝血酶標準品溶液各 20 μL，分別點在同一平皿中，放置 37 ℃ 18 h。測量沉淀圈垂直直徑，計算沉淀圈面積，利用凝血酶標準曲線計算供試品與凝血酶反應后效價單位(BP)，得到供試品中水蛭素的效價(ATU)。

水蛭素的生物效價(ATU)=(20 000 BP·L-1-剩余凝血酶活力BP·L-1)×稀釋倍數(shù)

1.5.3統(tǒng)計學方法 Markwardt 法采用容量分析法，瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)采用標準曲線法。

1.6 抗凝血酶活性生物效價測定法的建立與驗證[6-8]

1.6.1測定方法建立 按1.5方法篩選試驗結果，選擇活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價的測定方法。

1.6.2試驗系的考察 分別采用不同溶劑，同種溶劑不同提取方法、溫度和時間， 提取 1 g 活血通脈膠囊中的水蛭素，測定其效價。并對培養(yǎng) 8 和 18 h 的平板進行考察。

1.6.3方法學驗證

1.6.3.1 專屬性考察 分別制備活血通脈膠囊陰性對照樣品和空白回收樣品，按“1.6.1”試驗方法和“1.6.2”確定的試驗條件測定其效價。

1.6.3.2 標準曲線的制備 取凝血酶標準品加0.9% 氯化鈉溶液溶解，并稀釋成 5 000、7 500、10 000、150 000、20 000 BP·L-1的系列活力濃度，分別精密吸取上述標準品溶液20 μL 點樣，測量沉淀圈直徑。測定結果見Fig 1。

Fig 1 Thrombin standard curve

1.6.3.3 中間精密度考察 取供試品溶液(樣品3)，分別改變實驗室內部條件(不同人員、不同時間)，按“1.6.1”試驗方法和“1.6.2”確定的試驗條件，測定其效價。

1.6.3.4 重復性考察 取供試品溶液(樣品3)6 份，按“1.6.1”試驗方法和“1.6.2”確定的試驗條件測定其效價。

1.6.3.5 回收率試驗 采用加樣回收法，取已知含量活血通脈膠囊樣品(批號：樣品3，效價：62.403 U·g-1)，研細，稱取 6 份，(每份約0.500 g)，分別精密稱定，再精密量取水蛭素標準品(1 000 ATU·L-1) 60 μL分別加入樣品中，按“1.6.1”試驗方法和“1.6.2”確定的試驗條件測定其效價，并計算回收率。

1.6.3.6 溶液穩(wěn)定性試驗 取儲存于4 ℃ 下同一供試品溶液(樣品3)，分別在制備后0、24、48、72 h 點樣，測定其效價。

1.6.3.7 耐用性試驗 按“1.6.1”試驗方法分別選用進口及國產瓊脂糖制備平板，在兩板相應位置點同樣的樣品，觀察不同來源的瓊脂糖對實驗結果的影響。

1.6.4樣品測定 取3批活血通脈膠囊樣品(樣品1、樣品2、樣品3)，按1.4制備供試品溶液，按“1.6.1”試驗方法和“1.6.2”確定的試驗條件測定其效價，每樣品重復測定3次。

2 結果

2.1 不同抗凝血酶生物活性效價測定方法的考察

2.1.1Markwardt 法(凝血酶滴定法) Tab 1結果顯示，不同批號凝血酶、不同試驗時間及不同試驗人員測定同批水蛭和活血通脈膠囊抗凝血酶活性，RSD分別為 15.6%、12.9%。凝固情況分為兩種：局部形成凝塊后不再凝結和全部凝結，且滴定終點凝塊的形成隨著搖晃的力度和速度變化而變化，終點不易判斷。

Tab 1 Results of Markwardt bioassay of leech and Huoxuetongmai capsule

2.1.2瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法) Tab 2結果可見，不同試驗人員分別測定，水蛭和活血通脈膠囊抗凝血酶活性RSD分別為 3.5%、5.2%。

Tab 2 Results of fibrinogen bioassay of leech and Huoxuetongmai capsule

2.1.3不同測定方法的比較 瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)測定水蛭和活血通脈膠囊抗凝血酶生物效價的中間精密度RSD分別為3.5%、5.2%，優(yōu)于Markwardt法(RSD分別為15.6%、12.9%)。且測量指標易于量化，更加客觀。故選擇瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)，建立活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價的測定方法。

2.2 活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價測定法的建立與驗證

2.2.1試驗系的考察

2.2.1.1 供試品溶液處理方法的考察 試驗結果顯示0.9% 氯化鈉溶液提取效果好于水，5 mL 和10 mL 0.9% 氯化鈉溶液提取1 g活血通脈膠囊的水蛭素含量一致，10 mL 0.9% 氯化鈉溶液超聲 30 min 提取與浸泡 30 min 提取的水蛭素含量一致，10 ℃ 冷浸30 min 提取與常溫(30 ℃)浸泡30 min 提取的水蛭素含量一致，30 min 提取液與 4 h 提取液水蛭素含量一致。

綜合考慮到經(jīng)濟、節(jié)約、效能等因素，以0.9% 氯化鈉溶液為提取試劑，以 100 g·L-1比例、常溫浸提 30 min 提取供試品中的水蛭素。

2.2.1.2 不同培養(yǎng)時間考察 培養(yǎng)8 h 形成的沉淀圈不規(guī)則、不同劑量間無明顯差別；培養(yǎng)18 h 后沉淀圈形狀規(guī)則便于測量，選擇培養(yǎng)18 h。

2.2.2方法學驗證

2.2.2.1 專屬性考察 陰性對照樣品沉淀圈大小與凝血酶標準對照一致，空白回收樣品沉淀圈與樣品一致，陰性對照樣品對實驗結果無干擾。

2.2.2.2 纖維蛋白原平板法凝血酶標準曲線的制備 以凝血酶標準品活力濃度為橫坐標，沉淀圈面積為縱坐標計算回歸方程。結果表明，凝血酶濃度5～20 BP 范圍內，回歸方程 Y=40.9 + 4.94X，R2=0.994。可用于活血通脈膠囊中水蛭素效價的計算。見Fig 1。

2.2.2.3 中間精密度考察 取供試品溶液(樣品3)，分別改變實驗室內部條件(不同人員、不同時間)，測定樣品中水蛭素的效價，結果中間精密度 RSD 為 3.2%。

2.2.2.4 重復性考察 供試品溶液(樣品3)6 份，測定樣品中水蛭素的效價。結果重復性考察 RSD 為4.7%。

2.2.2.5 回收率試驗 結果見Tab 3，本法平均回收率為 98.26% (n=6)，RSD 為 2.3%。

Tab 3 Recovery test results

2.2.2.6 溶液穩(wěn)定性考察 儲存于4 ℃ 下供試品溶液，分別在制備后0、24、48、72 h點樣，測定其效價，供試品溶液在4 ℃ 下72 h 內穩(wěn)定。

2.2.2.7 耐用性 相應位置上，使用進口瓊脂糖的平板沉淀圈明顯小于使用國產瓊脂糖的平板，顯示不同來源和批號的瓊脂糖對本法測定結果有影響。

2.2.3 供試品測定Tab 4結果可見，三批供試品的效價測定結果分別為70.355、61.485、62.357 ATU·g-1；RSD分別為 5.0%、3.2%、4.7%。

Tab 4 Titer test results of three batches of samples

3 討論

水蛭始見于《神農本草經(jīng)》，是破血逐淤類經(jīng)典中藥。其生物活性物質多樣，依藥理作用可大致分為兩類，一類直接作用于凝血系統(tǒng)，如水蛭素、吻蛭素、類肝素等；另一類為其他蛋白酶抑制劑組分，如Decorsin、Hementin等。具有抗凝、抗血栓、抗腫瘤、抗細胞凋亡等多種藥理作用[9]，主要成分水蛭素是已知作用最強的凝血酶特異性抑制劑。纖維蛋白原在凝血酶的作用下生成纖維蛋白，繼而形成凝膠，這是血液凝固的基本過程，通過觀察藥物對凝血酶與纖維蛋白原水解反應的影響，可以評價藥物的抗凝血酶作用。

凝血酶是在生理狀態(tài)下唯一能將大量蛋白 C(PC)轉化為 APC 的絲氨酸蛋白酶，通過裂解纖維蛋白原，形成纖維蛋白單體，活化血小板，激活抗凝系統(tǒng)蛋白 C，在凝血過程中起重要作用。水蛭素可作用于凝血酶的非活性底物識別位點和酶活性中心識別位點，1 ∶1結合形成不可逆復合物，使后者失去活性[10]。其與血漿中的游離凝血酶結合速度比纖維蛋白原快，同時可中和與纖維蛋白結合的凝血酶。

目前水蛭素活性測定方法有 Markwardt 法，Chromozym TH 發(fā)色底物法，光散射法，纖維蛋白原平板法等。其中Chromozym TH 發(fā)色底物法和光散射法需配備進口試劑及儀器設備，成本較高，不利于推廣使用。

Markwardt法是《中國藥典》2015年版水蛭的含量測定方法，利用水蛭素與凝血酶反應速度較纖維蛋白原快，反應呈正比關系，選用適宜的滴定濃度，終點時稍過量凝血酶使纖維蛋白原產生凝固。血液凝固是一個連續(xù)過程，初凝出現(xiàn)的微量凝膠為透明狀，肉眼難以觀察，滴定終點也要靠試驗者的主觀判斷；同時有研究顯示，在滴定間隔時間和滴定時間固定的情況下，凝血酶單次滴加量不同，實驗結果有明顯差別[11]。本研究選用滴定濃度 30 000 BP·L-1，滴定中每隔1 min搖動，不利于形成纖維蛋白凝膠。其滴定過程不易控制，滴定終點不易觀察，易受環(huán)境溫度、人員操作熟練程度等的影響。同時結果用容量分析方法進行計算，誤差較大。該法測定的水蛭和活血通脈膠囊的抗凝血酶活性中間精密度RSD分別為 15.6%、12.9%。

瓊脂糖-纖維蛋白原平板法是將標準凝血酶及經(jīng)水蛭素1 ∶1抑制后的凝血酶滴加到瓊脂糖-纖維蛋白原平板加樣孔內，凝血酶在擴散過程中與纖維蛋白原形成酶-底物復合物，使纖維蛋白原水解，并發(fā)生交聯(lián)呈乳白色沉淀，在一定范圍內沉淀圈直徑與凝血酶活性呈正相關，利用標準曲線，可經(jīng)水蛭素抑制后剩余凝血酶的量，計算水蛭素的效價[12]。其評價指標與活血通脈膠囊功能主治相關，方法準確簡便、影響因素少、易于操作，具有較好的精密度和重復性，符合中藥生物活性測定的基本原則。耐用性試驗提示使用進口瓊脂糖的平板沉淀圈較國產瓊脂糖小，考慮到采用了標準曲線法，且供試品和凝血酶標準品的免疫擴散可同時在一塊纖維蛋白原平板上進行,有助于提高耐用性, 減少實驗誤差。

在瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)測定結果統(tǒng)計方法的選擇中，考慮量反應平行線法的一般原則是標準品應和樣品同質，活血通脈膠囊除水蛭素外，還包括類肝素、組織胺及多種其他蛋白酶抑制劑，從多個環(huán)節(jié)影響血液凝固、促進纖溶，故未采用量反應平行線法。 單點法測量沉淀圈直徑或面積計算效價，結果易受試劑如纖維蛋白和凝血酶、點樣誤差、平板制備等多種因素影響，重現(xiàn)性較差。故研究采用標準曲線法測定抗凝血酶生物效價，以有效控制實驗誤差。