毛蕊異黃酮對腦缺血/再灌注大鼠神經細胞凋亡的影響

張彐寧，高維娟，周曉紅，靳曉飛

(河北中醫學院河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷由缺血腦組織恢復血流供應所引起，是缺血性腦卒中治療過程中產生的病理性損傷[1]，凋亡在其病理進程中發揮了重要作用。毛蕊異黃酮是中藥黃芪的有效活性成分，是一種潛在的神經保護劑[2]，本研究旨在探討毛蕊異黃酮對腦缺血/再灌注損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD大鼠60只，♂，體質量280±20 g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2 主要試劑毛蕊異黃酮(上海士峰生物制品有限公司)；MCAO栓線(北京西濃科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)；甲苯胺藍染液、BCA 蛋白測定試劑盒(Solarbio)；尼莫地平、Bax和Bcl-2抗體(Servicebio)；caspase-3抗體(CST)；TUNEL染色試劑盒(Promega)。

1.3 主要儀器組織包埋機、切片機(Leica)；倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)；多功能成像系統(Vilber)。

1.4 實驗分組與模型制備參照文獻[3]的方法造模，根據Zea Longa 評分標準，1～3分者為造模成功，列為實驗對象。大鼠隨機分為：假手術組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg· kg-1，Calycosin)，采用TTC、HE和尼氏染色，觀察毛蕊異黃酮對腦缺血/再灌注大鼠的神經保護作用，篩選出毛蕊異黃酮最佳治療劑量，之后將大鼠隨機分為：假手術組、模型組、毛蕊異黃酮組(Calycosin，20 mg· kg-1)、尼莫地平組(Nimodipine，0.7 mg· kg-1，陽性對照藥組)，采用TUNEL染色和Western blot檢測各組大鼠神經細胞凋亡情況。各給藥組于再灌注的同時腹腔注射相應劑量藥物，給藥體積8 mL· kg-1，假手術組和模型組等體積腹腔注射生理鹽水。

1.5 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積造模給藥結束后，斷頭取腦，做冠狀位切片，用2% TTC染液恒溫避光孵育30 min，拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片并計算腦梗死體積。

1.6 HE染色觀察各組大鼠神經細胞病理形態學改變各組切片脫蠟至水，蘇木精浸染5～8 min，流水沖洗，鹽酸酒精分色，伊紅浸染1～3 min，自來水浸洗，最后脫水透明封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 尼氏染色檢測各組大鼠神經細胞尼氏體平均光密度值各組切片脫蠟至水，用1%甲苯胺藍恒溫避光孵育30 min，最后脫水透明封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 TUNEL染色檢測各組大鼠神經細胞凋亡情況按照試劑盒說明書，將各組切片利用蛋白酶K處理20 min，利用TUNEL反應混合液于37 ℃室溫避光孵育1 h。TUNEL陽性細胞在熒光顯微鏡下觀察成像。

1.9 Western blot檢測各組大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達各組蛋白樣品經電泳轉膜封閉后，分別用Bax、Bcl-2、caspase-3、β-actin一抗與膜上的抗原結合，4 ℃過夜，TBST洗去一抗，然后加入相應二抗與其反應，多功能成像系統下掃描成像。

2 結果

2.1 TTC染色檢測腦梗死體積的結果與Sham組相比，Model組大鼠TTC染色白色缺血區明顯，有明顯的梗死灶形成(P<0.05)；與Model組相比，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組腦梗死體積均有所減小(P<0.05)，其中以高劑量組最為明顯。見Tab 1。

Tab 1 Effects of calycosin on cerebral infarction volume and Nissl body in

2.2 HE染色觀察神經細胞病理形態的結果與Sham組相比，Model組細胞皺縮，核固縮、深染，神經細胞生長狀態較差；與Model組相比，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組神經細胞生長狀態明顯好轉，其中以高劑量組最為明顯。

2.3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均光密度值的結果與Sham組相比，Model組細胞皺縮，輪廓模糊不清，尼氏體明顯減少，并且平均光密度值明顯降低(P<0.05)。與Model組相比，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組尼氏體明顯增多，平均光密度值明顯增加(P<0.05)，其中以高劑量組最為明顯。見Tab 1。

2.4 TUNEL染色檢測神經細胞凋亡的結果與Sham組相比，Model組凋亡神經細胞明顯增多(P<0.05)。與Model組相比，Calycosin組和Nimodipine組凋亡神經細胞明顯減少(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Effects of calycosin on apoptosis and apoptotic proteins

2.5 Western blot檢測各組大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達的結果與Sham組相比，Model組促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達明顯升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)；與Model組相比，Calycosin組和Nimodipine組促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達明顯降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯升高(P<0.05)。見Tab 2。

3 討論

細胞凋亡在腦缺血/再灌注病理進程中扮演了重要角色，腦缺血/再灌注引起的神經細胞死亡方式主要以細胞凋亡為主[4-5]，有效抑制細胞凋亡對于減輕腦缺血/再灌注損傷具有重要意義。本研究發現， 腦缺血/再灌注損傷后，腦梗死體積明顯增大，神經細胞明顯收縮，胞核深染固縮，尼氏體明顯減少，凋亡神經細胞明顯增多，促凋亡蛋白Bax 、caspase-3表達明顯增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少。當給予毛蕊異黃酮處理后，腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積明顯減少，細胞狀態明顯改善，尼氏體明顯增多，凋亡神經細胞明顯減少，促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯升高。本研究初步表明毛蕊異黃酮可減小腦梗死體積，抑制神經細胞凋亡，減輕腦缺血/再灌注損傷，其分子機制與毛蕊異黃酮調控凋亡關鍵蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達密切相關。