南極磷蝦多肽的組成及其抗氧化與A C E抑制活性

劉小芳，顏征，冷凱良，2，*，孫如男，3，于源，苗鈞魁

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部極地漁業開發重點實驗室，山東青島266071；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島266200；3.青島大學藥學院，山東青島266021）

南極磷蝦（Euphausia superba）又名大磷蝦或南極大磷蝦，是一種生活在南極海域的小型甲殼類浮游動物[1]。南極磷蝦資源蘊藏量巨大，生物量達到6.5億噸～10億噸，具有成為我國第二個遠洋漁業的巨大潛力[2-3]。南極磷蝦中蛋白質含量豐富，約達到11.9%～16.3%（鮮基），且富含人體所需的多種必需氨基酸，是極具開發價值的海洋優質蛋白質資源[1，4]，但目前尚未得到充分利用。研究明確南極磷蝦蛋白的生物活性，精準定位應用領域，是提高南極磷蝦蛋白資源利用率和促進南極磷蝦產業發展的關鍵。

近年來，已有許多文獻報道多肽具有良好的生物活性，如抑菌、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、改善骨質疏松、抗腫瘤、調節免疫和保護心血管等[2，4，5-9]。因此，富含活性多肽的產品受到消費者的廣泛喜愛，多肽被應用于食品、藥品、保健品和化妝品等領域，具有良好的市場前景。常用的多肽提取方法有溶劑提取法、酶解提取法、超聲輔助提取法[10]，但存在多肽得率低、耗時長的缺點。近年來，為克服這些缺點，國內外學者開發了超聲輔助酶解、亞臨界水提取、雙酶法酶解等方法[11-14]，具有水解效果佳、肽得率高和活性好的優點。本文采用堿溶酸沉法與酶解法聯用的技術制備南極磷蝦多肽，初步分析多肽的組成及結構，重點評價其體外抗氧化和降血壓活性，以期為南極磷蝦蛋白資源的高效利用提供理論依據，為南極磷蝦多肽在相關領域的精準應用提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦凍蝦：由中國水產科學研究院黃海水產研究所“南極海洋生物資源開發與利用”項目組提供，打漿，攪拌均勻，保存于-80℃待用。

Lowry蛋白濃度測定試劑盒、ABTS、透析袋：北京索萊寶科技有限公司；血管緊張素I轉化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE，≥10 U/mg）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-L-苯丙酰胺-甘氨酸-甘氨酸{N-[3-（2-Furyl）acryloyl]-Phe-Gly-Gly，FAPGG}：Sigma-Aldrich公司；4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸 [4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES]、氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸（分析級）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ST3100型pH計：奧斯豪（常州）儀器有限公司；UV1102Ⅱ型紫外/可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；CTFD-10P型冷凍干燥機：青島永合創信電子科技有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋、SHA-B型恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司；BAS224S-CW型電子天平：賽多利斯（北京）科學儀器有限公司；Neofuge 15R型高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦蛋白的提取

采用堿溶酸沉法[15]（兩次堿溶、兩步酸沉）分離蛋白：稱取一定量的南極磷蝦蝦漿，加入蒸餾水[水料比6 ∶1（mL/g）]，攪拌均勻，調節 pH 值至 11.5，4 ℃攪拌浸提 30 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到上層液體A和沉淀A。將沉淀A進行二次堿溶，水料比為3 ∶1（mL/g），調節 pH 值至 11.5，4 ℃攪拌浸提 30 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到上層液體B和沉淀B。將液體A和液體B混合得到液體C，將液體C的pH值調至 5.5，靜置 20 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到沉淀D和上層液體D，將液體D的pH值調至4.6，靜置 20 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到沉淀 E，合并沉淀D和沉淀E，透析脫除鹽和單糖等物質，冷凍干燥即得南極磷蝦蛋白。

1.3.2 南極磷蝦多肽的制備

采用堿性蛋白酶酶解制備多肽[13]：稱取一定質量的南極磷蝦蛋白（1.3.1）分散于蒸餾水中[水料比25∶1（mL/g）]，攪拌均勻，調節pH值至9.0，50℃水浴15 min（預熱），加入堿性蛋白酶（6 000 U/g）酶解1 h（酶解溫度50℃，水浴振蕩速度150 r/min），100℃滅酶15 min，冷卻至室溫（25℃），將 pH 值調至 4.0，離心（5 000 r/min，30 min）收集上清液，調節pH值至7.0，抽濾后經正己烷對酶解液脫脂，冷凍干燥即得南極磷蝦多肽。

1.3.3 總蛋白質含量的測定

按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法的規定執行。

1.3.4 水解度的測定

水解度為酶解液中氨基酸態氮含量與總氮含量的比值。氨基酸態氮含量的測定按照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》中酸度計法的規定執行。總氮含量的測定按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法的規定執行。

1.3.5 多肽得率的測定

參照文獻[16]的方法進行測定：將酶解液（稀釋數倍）與等體積的10%的三氯乙酸混合，30℃水浴30min，然后5 000 r/min離心10 min，除去大分子蛋白質。采用Lowry法測定多肽濃度，多肽得率按下式計算：

1.3.6 多肽的紫外-可見光譜（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）檢測

稱取5mg多肽粉末（1.3.2）溶于10mL蒸餾水，采用紫外-可見分光光度計在230 nm～400 nm進行掃描[14]。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometry，FT-IR）檢測

采用傅里葉變換紅外分光光度計進行掃描，記錄500 cm-1至4 000 cm-1范圍內樣品的FT-IR光譜[14]。

1.3.8 多肽分子量測定

按照GB 31645-2018《食品安全國家標準膠原蛋白肽》中附錄A規定的方法執行。

1.3.9 多肽氨基酸組成分析

按照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》的規定執行。

1.3.10 多肽的還原力測定

參照文獻[17]的方法進行測定：1.5 mL多肽樣品溶液中加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）和1.5 mL鐵氰化鉀溶液（1%質量分數），混勻，50℃水浴20 min，加入0.75 mL三氯乙酸溶液（10%質量分數），4 000 r/min離心10 min。取1.5 mL上層清液與0.3 mL三氯化鐵溶液（0.1%質量分數），1.5 mL蒸餾水混勻，室溫（25℃）靜置10 min，在700 nm波長下測吸光值，吸光值越大還原能力越強。

1.3.11 清除DPPH自由基能力測定

參照文獻[13-14]的方法進行測定：2 mL多肽樣品溶液中加入2mLDPPH乙醇溶液（0.2mmol/L），混勻，室溫（25℃）避光靜置30min，離心（3500r/min，10min），在517 nm波長下測定吸光值。DPPH·清除率的計算公式為：

式中：A0為對照組吸光值；Ai為樣品組吸光值；Aj為空白組吸光值。

1.3.12 清除ABTS+自由基能力測定

參照文獻[18]的方法進行測定：將0.4 mL的樣品溶液與3.6 mL ABTS溶液混合，室溫（25℃）下避光反應5 min，在734 nm波長下測定吸光值。ABTS+自由基清除率的計算公式為：

式中：B0為對照組吸光值；Bi為樣品組吸光值；Bj為空白組吸光值。

1.3.13 清除羥自由基能力測定

參照文獻[17]的方法進行測定：在1 mL多肽樣品溶液中依次加入0.5 mL硫酸亞鐵（9 mmol/L），1 mL的水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL雙氧水（4.4 mmol/L）和2 mL蒸餾水，37℃水浴1 h，4 000 r/min離心15 min，在510 nm波長下測定吸光值。·OH清除率的計算公式如下：

式中：C0為對照組吸光值；Ci為樣品組吸光值；Cj為不加雙氧水的樣品吸光值。

1.3.14 ACE抑制活性

參照文獻[19-20]的方法進行測定。按表1所示，依次添加各反應組分，在37℃下溫育30 min，在340 nm波長下分別測定各孔在0、30 min的吸光值。

表1 南極磷蝦多肽的ACE抑制活性測定Table 1 ACE inhibitory activity of the Antarctic krill polypeptides

ACE抑制率的計算公式如下：

式中：A為對照孔吸光值的減少值；B為樣品孔吸光值的減少值。

2 結果與分析

2.1 水解度和肽得率

采用堿溶酸沉法和酶解法聯用制備南極磷蝦多肽，具有較好的水解度和多肽得率，分別達到（17.83±3.73）%和（57.20±0.24）%。劉璐等[21]采用單因素和正交試驗優化了堿性蛋白酶酶解制備南極磷蝦多肽的工藝，在最佳條件下，水解度略高于本研究，但酶解時間是本研究的5倍。張元元等[22]采用單因素和響應面試驗優化南極磷蝦多肽的酶解制備工藝，水解度為12.88%，低于本研究結果。

2.2 紫外-可見吸收光譜

南極磷蝦多肽的紫外-可見吸收光譜如圖1所示，南極磷蝦多肽的特征吸收波長范圍在270 nm～280 nm，最大特征吸收波長為273.5 nm。

圖1 南極磷蝦多肽的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectra of the Antarctic krill polypeptides

2.3 FT-IR光譜

南極磷蝦多肽的傅里葉變換紅外光譜如圖2所示。

圖2 南極磷蝦多肽的FT-IR光譜Fig.2 FT-IR spectra of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽具有多肽的特征吸收峰[23]，在3 390.84 cm-1處有N-H伸縮振動的強吸收峰（酰胺A帶），在2 917.66 cm-1處有C-N伸縮振動的特征吸收峰（酰胺B帶）[23-24]，在 1 648.36 cm-1有C＝O伸縮振動所引起的特征吸收峰（酰胺I帶），1 547.59 cm-1處的特征吸收峰歸屬于酰胺II帶，在1 402.21 cm-1處有C＝O伸縮振動和N-H彎曲振動所引起的吸收峰（酰胺III帶）[14，25-27]。

2.4 多肽的分子量分布

南極磷蝦多肽的分子量分布如圖3所示。

圖3 南極磷蝦多肽的分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽的分子量主要在189 Da～6500 Da，符合生物活性肽分子量分布范圍[28]，其中，451 Da～1 450 Da占比最高（41.00±0.05）%。劉云姣等[29]使用胰蛋白酶酶解制備南極磷蝦多肽，采用凝膠電泳分析發現多肽分子量主要集中分布在5 kDa以下，與本研究結果相似。

2.5 多肽的氨基酸組成分析

南極磷蝦多肽的氨基酸組成與含量如表2所示。

南極磷蝦多肽共檢出17種氨基酸，含有7種必需氨基酸，其中，谷氨酸含量最高，占總氨基酸含量的14.00%，天冬氨酸含量次之，占總氨基酸含量的11.76%。必需氨基酸占比為40.32%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為67.56%，均符合聯合國糧農組織/世界衛生組織規定的標準（必需氨基酸占氨基酸總量的40%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為60%），說明南極磷蝦多肽營養價值良好，符合理想模式[30-31]。

表2 南極磷蝦多肽的氨基酸組成與含量Table 2 Amino acid compositions of the Antarctic krill polypeptides

2.6 多肽的還原能力

南極磷蝦多肽的還原能力如圖4所示。

圖4 南極磷蝦多肽的還原能力Fig.4 Reducing power of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽具有顯著的還原能力。隨著多肽濃度增大，吸光值增大，說明還原能力越來越強，與史亞萍等[32]的研究具有相同的趨勢。Ambigaipalan等[33]從蝦殼加工廢棄物中制備多肽，也具有顯著的還原能力。

2.7 多肽清除DPPH自由基能力

南極磷蝦多肽清除DPPH·的能力如圖5所示。

圖5 南極磷蝦多肽的DPPH·清除活性Fig.5 DPPH·scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽濃度為1 mg/mL～8 mg/mL時，DPPH·清除率為（16.87±3.81）% ～（60.73±1.50）%。隨著多肽濃度的升高，清除能力增強，與張元元等[22]的研究結果一致，但本研究所制備的南極磷蝦多肽的清除DPPH·的能力更強。經計算，南極磷蝦多肽清除DPPH·的 IC50值為 5.65 mg/mL。

2.8 多肽清除ABTS+自由基

南極磷蝦多肽清除ABTS+自由基的能力如圖6所示。

圖6 南極磷蝦多肽的ABTS+自由基清除活性Fig.6 ABTS+scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽以濃度依賴的方式清除ABTS+自由基，清除能力顯著。當多肽濃度為2 mg/mL時，ABTS+自由基清除率達到（93.81±0.10）%。經計算，南極磷蝦多肽清除ABTS+自由基的IC50值為0.17 mg/mL。與牛脊髓肽[18]、烏賊墨多肽[34]和豬腦水解肽[35]相比，南極磷蝦多肽具有較強的清除ABTS+自由基能力，說明南極磷蝦是多肽類抗氧化劑的良好來源。

2.9 多肽清除羥自由基

南極磷蝦多肽清除·OH的能力如圖7所示。

隨著南極磷蝦多肽濃度的增加，·OH清除率逐漸提高，當多肽濃度為10 mg/mL時，·OH清除率達到（96.22±3.50）%。經計算，南極磷蝦多肽清除·OH的IC50值為4.46 mg/mL。

圖7 南極磷蝦多肽的·OH清除活性Fig.7·OH scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

2.10 多肽的ACE抑制活性

南極磷蝦多肽的ACE抑制活性見圖8。

圖8 南極磷蝦多肽的ACE抑制活性Fig.8 ACE inhibitory activity of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽具有顯著且良好的抑制ACE的能力，隨著多肽濃度增大，多肽抑制ACE的能力增強。當多肽濃度為0.5 mg/mL時，ACE抑制率為（55.91±2.63）%。高穎等[36]通過研究發現低氟南極磷蝦肽也具有良好的抑制ACE活性；Zhao等[7]采用超濾法和色譜法從南極磷蝦蛋白水解物中分離出8種降血壓肽，特別是Trp-Phe和Phe-Ala-Ser對ACE表現出明顯的抑制活性；以上研究結果說明南極磷蝦是多肽類降血壓劑的良好來源。

3 結論

本文采用堿溶酸沉（兩步堿溶、兩步酸沉）與堿性蛋白酶酶解聯用法制備南極磷蝦多肽，具有較好的水解效果和較高的肽得率，所得多肽的分子量≤6 500 Da（98.93%），氨基酸組成理想，且多肽呈現良好的抗氧化活性和ACE抑制活性，南極磷蝦是制備多肽類抗氧化劑和降血壓劑的良好原料。未來研究可對獲得的南極磷蝦多肽進一步分離純化，篩選得到活性最優組分，并解析其構效關系，開發出具有特定功效的活性肽產品。本研究可為南極磷蝦多肽在相關領域的精準應用提供科學指導，推動南極磷蝦資源的高效高質利用。