不同提取方法對(duì)南酸棗果膠多糖理化性質(zhì)及抗氧化作用的影響

張陽(yáng)，王文君，2，譚妙英，李景恩，2，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

南酸棗系漆樹(shù)科南酸棗屬植物，其果實(shí)又名五眼果、山棗、醋酸果，主要分布于我國(guó)湖北、湖南、福建、江西、四川等地。南酸棗鮮果成熟時(shí)呈黃金色，橢圓形，生食略帶酸澀，果實(shí)中富含豐富的果膠物質(zhì)，常被加工成酸棗糕、酸棗蜜餞、酸棗功能性飲料、酸棗軟糖等[1-5]。果膠除了在食品加工中可作為膠凝劑、增稠劑、乳化劑、質(zhì)構(gòu)改良劑等，還具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和抗癌等生理活性[6-7]。工業(yè)上主要從蘋果渣和柑橘皮中提取果膠，隨著人們對(duì)食品加工多樣性的需求，更多不同結(jié)構(gòu)和功能的果膠產(chǎn)品亟待研究與開(kāi)發(fā)。

目前果膠的提取方法主要包括水提法、酸法、堿法和螯合法等。其中水提法只能提取一些易溶于水的果膠，大量不溶于水的果膠將被浪費(fèi)[8]。酸法是商業(yè)化生產(chǎn)果膠最常用的方法，該法將非水溶性的原果膠及果膠鹽在酸性條件下轉(zhuǎn)化成水溶性果膠，有利于提高果膠的提取率[9]；堿法則是通過(guò)釋放與多酚或其他物質(zhì)結(jié)合的果膠組分，以增加果膠的水溶性[10]；螯合法通過(guò)使用一些螯合劑，如草酸銨、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等與果膠中的鈣離子發(fā)生結(jié)合，從而降低果膠分子之間的交聯(lián)，增加其在水中的溶解度[11]。提取方法不同，果膠組成和性質(zhì)也會(huì)存在一定的差異。本研究分別采用水提法、酸法、堿法和草酸銨法從南酸棗果肉中提取不同的果膠多糖，并比較其理化性質(zhì)及抗氧化作用，為進(jìn)一步探討果膠結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮南酸棗：江西省贛州市崇義縣，洗凈、去核、烘干、粉碎后備用。

3-苯基苯酚、四硼酸鈉、葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)G-250、硼氫化鈉：上海阿拉丁科技股份有限公司；D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品：索萊寶生物科技有限公司；DPPH、光譜純溴化鉀、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖）：美國(guó)Sigma公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分別為 1 152、5 200、11 600、23 800、48 600、148 000、273 000、410 000、668 000 Da）：美國(guó) Waters公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

V-5600型紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；TDL-A型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；YP-2型壓片機(jī)：上海山岳科學(xué)儀器有限公司；Nicolet-iS5型傅里葉變換紅外光譜儀：美國(guó)熱電公司；DZF-6090Z型真空干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LC-10A型高效液相色譜儀、GC/MS-QP 2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）：深圳市博睿糖生物技術(shù)有限公司；Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國(guó)瑞思泰康科技（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

新鮮南酸棗經(jīng)清水浸泡清洗后，去皮去核。果肉部分用無(wú)水乙醇回流1 h，用于去除部分單糖、寡糖、脂類及一些色素，重復(fù)回流5次，將所得果肉進(jìn)行真空干燥，粉碎、過(guò)篩（20目）后備用。

1.3.2 4種果膠多糖的制備

稱取6 g預(yù)處理過(guò)的南酸棗果肉樣品4份，按料液比1∶20（g/mL）分別加入蒸餾水、50 mmol/L鹽酸、50 mmol/L氫氧化鈉和80 mmol/L草酸銨溶液，分別于25、85、0℃和 25℃，磁力攪拌提取 30 min，連續(xù)提取3次[12]。提取結(jié)束后，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，除去下層果肉殘?jiān)蛏锨逡褐芯徛尤?倍量無(wú)水乙醇，攪拌均勻后靜置過(guò)夜。充分沉淀后以4 000 r/min離心10 min，除去上清液，分別得到水提、酸提、堿提和草酸銨提果膠多糖。為了除去樣品中殘留的乙醇、酸、堿和草酸銨鹽，需進(jìn)行透析處理（截留分子量>3 400 Da）。以上樣品經(jīng)冷凍干燥后稱重，按照公式（1）計(jì)算得率。

式中：m1為果肉質(zhì)量，g；m2為果膠多糖質(zhì)量，g。

1.3.3 基本化學(xué)組成測(cè)定

采用干燥法[13]測(cè)定水分含量；采用灼燒法[14]測(cè)定灰分含量；采用考馬斯亮藍(lán)法[15]測(cè)定蛋白質(zhì)含量；采用間羥基聯(lián)苯法[16]測(cè)定半乳糖醛酸含量；采用苯酚-硫酸法測(cè)定中性糖含量[17]。

1.3.4 高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測(cè)定分子量

分別精確稱取10 mg樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，配制成5 mg/mL的溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾，然后轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣量20 μL。以不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（1 152、5 200、11 600、23 800、148 000、273 000、410 000 Da）作對(duì)照，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品的分子量。

1.3.5 中性單糖組成測(cè)定

精密稱取2 mg果膠多糖樣品，用1 mL三氟乙酸（2 mol/L）水解90 min，旋轉(zhuǎn)蒸干。加入2 mL蒸餾水，及100 mg硼氫化鈉進(jìn)行還原，之后加冰醋酸中和，再次旋蒸濃縮。將產(chǎn)物置于110℃烘箱徹底烘干，然后加入1 mL醋酐進(jìn)行乙酰化反應(yīng)（100℃，1 h），冷卻后加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復(fù)操作4次～5次，除去反應(yīng)物中殘留的醋酐。將乙酰化產(chǎn)物用3 mL氯仿溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加少量蒸餾水充分振蕩，除去水層，重復(fù)操作5次。下層氯仿層以少量無(wú)水硫酸鈉干燥，定容至10 mL容量瓶備用。

上述乙酰化產(chǎn)物采用GC/MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行單糖種類測(cè)定。采用Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進(jìn)行分離；升溫程序設(shè)定為：起始溫度120℃，以3℃/min升溫至250℃/min后，保持5 min；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250℃，氦氣作為載氣，流速1 mL/min。

1.3.6 紅外光譜測(cè)定

稱取4種果膠樣品，加入光譜純的KBr晶體作為分散基質(zhì)，研磨成粉后進(jìn)行壓片，利用Nicolet-iS5型傅里葉變換光譜儀在400 cm-1～4 000 cm-1范圍進(jìn)行掃描，比較4種果膠多糖的紅外光譜特征。

1.3.7 抗氧化作用研究

分別采用DPPH自由基、羥基自由基（·OH）清除力和還原力試驗(yàn)，比較4種果膠多糖的抗氧化作用[18]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用鄧肯法進(jìn)行均值比較，以p＜0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)；IC50值采用Origin 6.0軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)組成分析

4種方法所制備果膠多糖得率、水分、灰分、蛋白質(zhì)、中性糖、半乳糖醛酸含量見(jiàn)表1。

表1 南酸棗果膠多糖的得率和基本化學(xué)組成Table 1 The yield and chemical compositions of pectin polysaccharides from Choerospondias axillaris fruit %

由表1可見(jiàn)，4種方法制備的果膠多糖得率分別為20.31%、25.33%、24.54%、21.71%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各得率間存在顯著性差異。酸法得率最高，其次是堿法、草酸銨法，水提法得率最低，可見(jiàn)酸、堿、鹽均能不同程度提高南酸棗果膠多糖的得率。

4種果膠多糖的化學(xué)組成有一定的差別，其中堿法和草酸銨法的中性糖含量最高，其次是酸法，水提法中性糖含量最低。4種果膠多糖中，堿提樣品的糖醛酸含量最高，其次是草酸銨法，但均未達(dá)到國(guó)標(biāo)要求（≥65%，GB 25533-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑果膠》）[19]，因此，本文中制備的是一種果膠類多糖，需進(jìn)一步純化。

4種樣品中，草酸銨法具有最低的灰分含量，可能是因?yàn)椴菟徜@在螯合Ca2+的同時(shí)，也螯合了其它離子，在透析過(guò)程中被一同除去。酸提果膠多糖的灰分含量最高，可能是由于提高溶液酸度有利于其它礦物質(zhì)的溶出，而這些礦物質(zhì)在多糖醇沉過(guò)程中被一同沉淀[20]。

2.2 不同提取方法對(duì)分子量的影響

利用HPGPC法對(duì)樣品的分子量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 4種南酸棗果膠多糖的分子量分布圖Fig.1 Molecular weight distribution of four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaris fruit

由峰A、B、C可知，草酸銨法和水提法得到的果膠多糖中含有部分游離寡糖。將不同分子量葡聚糖標(biāo)品的峰位分子量（peak molecular weight，Mp）、重均分子量（weight-average molecular weight，Mw）和數(shù)均分子量（number-average molecular weight，Mn）取對(duì)數(shù)后對(duì)保留時(shí)間（retention time，RT）進(jìn)行回歸分析，分別得到lgMp-RT，lgMw-RT，lgMn-RT3條校正曲線（y1＝-0.270 5x1+12.454，R2＝0.997 4；y2＝-0.285 1x2+12.969，R2＝ 0.994 5；y3＝-0.266 6x3+12.261，R2＝0.993 9）。根據(jù)保留時(shí)間，計(jì)算樣品的分子量（見(jiàn)表2）。

表2 4種南酸棗果膠多糖的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布Table 2 The relative molecular weight and its distribution of four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaris fruit

由圖1和表2得出，不同方法制備的南酸棗果膠多糖分子量分布不均一，且分布范圍較寬，基本都包含3種不同分子量的組分。除堿法外，其他3種樣品的峰位分子量、重均分子量和數(shù)均分子量基本無(wú)顯著性差異。水提多糖中1號(hào)和2號(hào)峰為主峰，重均分子量Mw 分別為 1.52×106Da和 1.41×105Da，分散系數(shù)（Mw/Mn）分別為1.85和1.59，表示分子量分布較為分散。酸提多糖2號(hào)峰的峰高有所下降，1號(hào)峰為主峰，Mw約2.01×106Da。堿提多糖出峰時(shí)間較晚，說(shuō)明樣品在堿性條件發(fā)生部分降解，分子量下降。草酸銨法多糖的出峰信號(hào)遠(yuǎn)低于其他方法，可能是由于樣品純度較低。

2.3 不同提取方法對(duì)中性糖組成的影響

圖2是7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和4種南酸棗果膠多糖乙酰化衍生物的氣相色譜圖，各單糖標(biāo)品的出峰順序從左到右依次為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。依據(jù)出峰時(shí)間確定單糖種類，然后將峰面積分別代入各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算摩爾百分比，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和4種南酸棗果膠多糖乙酰化衍生物的氣相色譜圖Fig.2 Gas charomaogram of acetylated derivatives of monosaccharide standards and four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaris fruit

表3 4種南酸棗果膠多糖的中性糖單糖組成摩爾比Table 3 The molar ratio of neutral monosaccharide of four pectic polysaccharides isolated from Choerospondias axillaris fruit %

由表3可見(jiàn)，草酸銨法中葡萄糖和甘露糖含量較高，說(shuō)明圖1中的寡糖（峰A、峰B、峰C）主要由葡萄糖和甘露糖組成。其它3種方法制備的多糖中阿拉伯糖和半乳糖含量較高，而巖藻糖和木糖含量較少。鼠李糖含量均顯示較低，表明南酸棗果膠可能屬于RG II型鼠李半乳糖醛酸聚糖，即主鏈由α-1，4-糖苷鍵連接的線型半乳糖醛酸聚糖組成[21]，精細(xì)結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。

2.4 紅外光譜分析（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）

利用FT-IR法對(duì)4種樣品的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行初步表征，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 4種南酸棗果膠多糖紅外光譜圖Fig.3 FT-IR of four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaris fruit

紅外光譜顯示，4種果膠多糖在500cm-1～4000cm-1范圍內(nèi)均具有明顯的糖類的特征吸收峰。在3200 cm-1～3 600 cm-1之間的寬峰，是糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)的結(jié)果；2 933 cm-1左右的肩峰是甲基（-CH3）和次甲基的（-CH2）的 C-H伸縮振動(dòng)峰。1 600 cm-1～1 800 cm-1處的振動(dòng)是果膠的典型吸收區(qū)域，這個(gè)區(qū)域包括 1 630 cm-1～1 650 cm-1和 1 740 cm-1～1 760 cm-1兩個(gè)吸收峰，分別代表了自由羧基（-COOH）和酯化羧基（-COOR）的C＝O振動(dòng)，其中甲酯化羧基吸收峰的大小與果膠的酯化度成正比[22]。由圖3可見(jiàn)，水提法、酸法、草酸銨法制備的果膠多糖在1 750 cm-1附近的振動(dòng)峰依次減小，而堿法樣品中該峰基本消失，可能是由于堿性條件下發(fā)生酯化的甲氧基被水解[23]。1 420 cm-1處吸收峰是C-H的變角振動(dòng)，它和3 200 cm-1～3 600 cm-1處的C-H伸縮振動(dòng)構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收。另外，1 082 cm-1左右的強(qiáng)吸收峰是糖苷鍵C-O-C的非對(duì)稱振動(dòng)峰，為吡喃糖的特征吸收峰[24]。890 cm-1附近吸收峰表明有β-型糖苷鍵；在839 cm-1處的吸收峰表明有α-型糖苷鍵存在[25]。

2.5 抗氧化作用研究

2.5.1 DPPH·清除作用

4種南酸棗果膠多糖對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)圖4。

圖4 4種南酸棗果膠多糖對(duì)DPPH·的清除作用Fig.4 DPPH·scavenging effects of four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaries fruit

如圖4所示，在試驗(yàn)濃度內(nèi)（78μg/mL～5000μg/mL）4種果膠多糖對(duì)DPPH·均有一定的清除能力，且隨濃度增大，各樣品對(duì)DPPH·的清除率也逐漸增加。在最高濃度下，水提法、酸法、堿法、草酸銨法對(duì)DPPH·的最大清除率分別為57.7%、41.7%、64.6%、54.6%，而堿法對(duì)DPPH·的清除力最強(qiáng)，其次為水提法，酸法對(duì)DPPH·的清除能力最弱。抗壞血酸在最低濃度78 μg/mL時(shí)，清除率已高達(dá)90.6%；經(jīng)計(jì)算堿法和草酸銨法的 IC50分別為 3 077 μg/mL 和 4 326 μg/mL。

2.5.2 ·OH清除作用

4種南酸棗果膠多糖對(duì)·OH的清除作用見(jiàn)圖5。

圖5 4種南酸棗果膠多糖對(duì)·OH的清除作用Fig.5Hydroxyl radical（·OH）scavenging effects of four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaries fruit

如圖5所示，4種果膠多糖對(duì)·OH的清除率，隨樣品濃度的增加而增加。其中堿法對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)，水提法其次，酸法和草酸銨法清除力相似。在最大濃度時(shí)，水提法、酸法、堿法、草酸銨法對(duì)·OH的清除率分別達(dá)到41.3%、28.4%、55.3%、28.3%。可見(jiàn)，堿法制備的果膠多糖具有相對(duì)較高的清除率，計(jì)算其IC50為 3 694 μg/mL，而抗壞血酸的 IC50值僅為 150 μg/mL。

2.5.3 還原力結(jié)果

還原力是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化性的一個(gè)重要指標(biāo)，吸光度越大，表示還原力越大[26]。4種南酸棗果膠多糖的還原力結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 4種南酸棗果膠多糖的還原力Fig.6 The reducing power of four pectic polysaccharides from Choerospondias axillaries fruit

如圖6所示，4種果膠多糖的還原力均隨濃度增大而增大，其中堿提法具有相對(duì)較強(qiáng)的還原力，而其他3種方法的還原力在試驗(yàn)范圍內(nèi)無(wú)顯著性差異。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樣品的吸光度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于相同濃度抗壞血酸的吸光度，說(shuō)明南酸棗果膠多糖的還原力較低。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，堿法提取的果膠多糖具有較好的抗氧化活性，水提法次之，酸法和草酸銨法較弱。一方面，堿性環(huán)境使酯鍵發(fā)生部分水解，羧基重新游離出來(lái)；另一方面，堿性條件降低了多糖的分子量，有利于抗氧化作用的發(fā)揮[27-28]。

3 結(jié)論

本文采用4種不同的溶劑從南酸棗果肉中提取果膠類多糖，并初步分析其化學(xué)組成、分子量分布、紅外光譜性質(zhì)及體外抗氧化作用。結(jié)果表明，4種果膠多糖的理化性質(zhì)及抗氧化作用具有顯著性差異。分子量分布結(jié)果表明南酸棗果膠多糖是由3個(gè)不同分子量的組分組成，有待進(jìn)一步純化。紅外光譜顯示，4種樣品在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出果膠物質(zhì)的特征吸收峰，說(shuō)明屬于果膠類多糖。除堿法外，其它3種方法提取的果膠多糖在1 748 cm-1和1 626 cm-1附近均出現(xiàn)明顯的糖醛酸特征峰；堿提果膠在1 748 cm-1處的吸收峰消失，可能是由于大部分甲氧基在堿性條件下被水解下來(lái)。抗氧化結(jié)果表明，4種果膠多糖清除DPPH·和·OH的能力及對(duì)Fe3+的還原力都與樣品濃度呈正比，其中堿法制備的果膠多糖表現(xiàn)出相對(duì)較好的抗氧化作用。通過(guò)研究不同提取方法對(duì)南酸棗果膠多糖的理化性質(zhì)和抗氧化作用的影響，可以從理化性質(zhì)方面為果膠類多糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供一定的理論參考。