香蕉果酒發酵過程中主要成分變化規律的研究

韋璐，孫欽菊，黃杰，陳彥偉，蔣上元，張偉坤

（1.廣西農業職業技術學院，廣西南寧530007；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

香蕉，隸屬芭蕉科（Musaceae），富含碳水化合物、礦物質和多種維生素，同時含有酚類、類黃酮等活性成分物質，具有潤腸通便、抗氧化等保健功效[1]。香蕉采摘后易熟易壞，需及時加工[2]。香蕉果酒是利用香蕉果汁，經釀酒酵母發酵后而形成的低酒精度飲料酒。香蕉成熟后糖含量較高，適宜釀造果酒，它具有香蕉的特征香味，酒體醇正，基本保留了香蕉中的天然營養成分，具有一定的保健功能[3]。低溫發酵過程緩慢，酵母菌能充分發揮產香作用[4]，低溫限制了各種化學反應的速度，果酒中的揮發酸含量相對較少[5]，更有利于保留香蕉豐富的風味物質和香蕉濃郁的特征香氣。

本試驗采用低溫發酵的方法，控制發酵溫度在（20±3）℃釀造香蕉果酒，跟蹤測定香蕉果酒在主發酵期間理化指標和活性成分的含量，通過測定香蕉果酒發酵過程中的香蕉果酒香蕉果酒酒精度、糖度、還原糖、吸光度、pH值、總糖、黃酮、多酚，掌握主要的理化指標和活性成分的變化規律，對香蕉果酒的品質進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香牙蕉：市售；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；纖維素酶（10 000 U/g）、果膠酶（500 U/mg）、白砂糖、焦亞硫酸鉀（均為食品級）：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；檸檬酸、無水亞硝酸鈉、沒食子酸、蘆丁、福林酚、茚三酮、3，5-二硝基水楊酸、磷酸、無水碳酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、無水亞硫酸鈉、苯酚、硫酸、無水葡萄糖、磷酸二氫鈉、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 主要儀器設備

T6型新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；WZS32手持阿貝折光儀：上海儀電物理光學儀器股份有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；MC-SH2112電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；DL-1電子萬用爐：北京市永光明醫療儀器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學有限公司；XH-C渦旋混合器：江蘇金怡儀器科技有限公司；電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；3H16RI智能高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；BCD-645WKPZM電冰箱：合肥美的電冰箱有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香蕉果酒制備工藝流程

1.3.2 測定方法

按照1.3.1的工藝釀造香蕉果酒，發酵期間每隔24 h取樣進行檢測。其中pH值和酒精度直接進行檢測，其余檢測項目則是將發酵液于5℃經8 000 r/min離心15 min后，取上清液進行檢測。

1.3.2.1 理化指標檢測

酒精度的測定：采用酒精計法。

糖度的測定：用手持阿貝折光儀測定，以可溶性固形物計。

吸光度A的測定：參考黎星辰等[6]的研究方法，取澄清后香蕉果酒的上清液，以蒸餾水作參比，用1 cm厚的比色皿，在波長420 nm處測定吸光度。

pH值的測定：采用pH計測定。

1.3.2.2 還原糖含量的測定

采用 3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定[7]。取樣液 1 mL，加 1 mL 緩沖溶液和2 mL DNS試劑，混勻后沸水浴5 min，冷卻后加蒸餾水定容至25 mL，于540 nm處測吸光度，樣品中還原糖的百分含量按下列公式進行計算：

式中：c為樣品還原糖的濃度，mg/mL；V為樣品體積，mL；m為樣品質量，g；1 000為mg換算成g的系數。

1.3.2.3 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定[8]。取樣品1 mL于試管中，加蒸餾水至總體積1.0 mL，接著向試管依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL硫酸，靜置10 min后渦旋使其充分混合，置于30℃水浴20 min，于490 nm處測吸光度值。樣品中總糖的百分含量按下列公式進行計算：

式中：m1為查標準曲線得到的樣品含糖量，μg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質量，g；V2為比色測定時樣品的體積，mL；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

1.3.2.4 總多酚含量的測定

總多酚含量采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法測定[9]。取樣品1 mL于試管中，加蒸餾水至總體積10 mL，搖勻后加入5.0 mL10%Folin-Ciocalteu顯色劑，搖勻后靜置3 min～8 min后再加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻后靜置1 h，于765 nm處測吸光度，根據標準曲線回歸方程得到樣品中總多酚含量。

1.3.2.5 總黃酮含量的測定

總黃酮含量參考趙媛等[10]的研究方法。取樣品1 mL于試管中，各管加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液后搖勻，靜置6 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min再加入4.0 mL 4%氫氧化鈉，各管加入42%乙醇溶液使總體積為10 mL，靜置30 min后于510 nm處測吸光度值，根據標準曲線回歸方程得到樣品中總黃酮含量。

1.3.2.6 氨基酸含量的測定

參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[11]。

采用日立L-8900高速氨基酸分析儀進行氨基酸的測定。測定條件為：色譜柱：磺酸型陽離子樹脂；檢測波長：570 nm和440 nm；檢測器：可見光檢測器；分離柱溫：57℃；反應柱溫：135℃。

1.3.2.7 有機酸含量的測定

有機酸含量測定采用高效液相色譜法[12]。

色譜柱：CAPECELL PAK MG S5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.5%磷酸二氫銨緩沖溶液；檢測波長：200 nm；進樣量為 20 μL；柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min。

1.4 數據處理

試驗所得數據采用Origin 9.1軟件進行數據處理及繪圖，采用Adobe Illustrator CS5軟件進行數據圖表的修飾。

2 結果與分析

2.1 香蕉果酒發酵過程中酒精度和糖度的變化

香蕉果酒發酵過程中，酵母菌利用糖生成乙醇、多元醇、乙醛和乙酸等物質[13]，糖度是指發酵液中尚未被酵母菌利用的糖分，其中乙醇是酵母代謝的主產物，乙醇含量是衡量發酵是否正常的重要指標。香蕉果酒發酵期間酒精度和糖度的變化見圖1。

圖1 香蕉果酒發酵期間酒精度和糖度的變化Fig.1 Changes in alcohol content and sugar content during fermentation of banana wine

由圖1可知，香蕉果酒的主發酵周期為11 d，在發酵過程中，隨著發酵時間的增加，發酵液的酒精度呈上升趨勢，糖度呈下降趨勢，均在發酵2 d～7 d有大幅度變化，整體變化幅度相似。在剛接種發酵的1 d～2 d，酵母需要適應環境，并利用發酵罐中充足的氧氣進行生長繁殖，并未立刻開始進行發酵，故糖度和酒精度都沒有變化。3 d～4 d酵母的代謝活動最活躍，此時糖度的消耗速度最快，糖分被酵母用于生長繁殖和進行酒精發酵，酒精含量急劇上升。從發酵的第5天開始，糖度和酒精變化幅度變小，發酵第9天時，糖度不再下降，此時酒精度達到最高值，后期基本處于平緩狀態。發酵后期酵母的代謝活動變慢，這可能是因為糖類被消耗，不能給酵母提供充足的營養物質，發酵液的pH值不再適宜酵母生長；同時隨著發酵液中的酒精不斷積累，對酵母的毒性增大，酒精濃度過高，容易抑制糖酵解過程中的關鍵酶的活性，降低酵母消耗葡萄糖的速度，從而影響細胞的生長速率[14]。

2.2 香蕉果酒發酵過程中吸光度的變化

香蕉果酒在發酵過程中容易褐變，測定不同時期發酵液的吸光度，可了解香蕉果酒的褐變程度。香蕉果酒發酵期間吸光度的變化見圖2。

圖2 香蕉果酒發酵期間吸光度的變化Fig.2 Changes in absorbance values during the fermentation of banana wine

由圖2可知，在發酵的前4 d，吸光度呈上升趨勢，發酵第2天吸光度急劇上升，第4天吸光度是發酵過程中的最高值，高達0.24，之后整體呈緩慢下降趨勢。前4 d吸光度上升的原因可能是因為酵母經過短暫的調整期后，進入指數期，酵母利用發酵液中充足的營養物質開始生長繁殖，酵母數量急劇增加。4 d～11 d，吸光度降低的原因可能是營養物質被消耗，不足以提供給予酵母用于生長繁殖，前4 d積累產生的乙醇、乙酸等物質開始抑制酵母的生命活動，酵母的生存空間也變小，酵母進入衰亡期，酵母數量大幅度減少；由于有機酸對酶促褐變有抑制作用，有可能是代謝的副產物如乙酸的含量增加，抑制果酒酶促褐變；也可能是由于各類反應結束，發酵液中大部分懸浮物質開始逐漸沉淀到發酵罐底部，果酒變得澄清透明。

2.3 香蕉果酒發酵過程中pH值的變化

香蕉果酒的發酵過程中，發酵液的pH值可以反映環境的酸度，即游離氫離子濃度的多少，酸性環境能有效抑制雜菌的生長，減少香蕉果酒發酵過程中被雜菌污染的可能[15]。

香蕉果酒發酵期間pH值的變化見圖3。

圖3 香蕉果酒發酵期間pH值的變化Fig.3 Changes in pH during the fermentation of banana wine

由圖3可知，香蕉果酒在發酵期間發酵液的pH值先降低后緩慢升高，到后期趨于穩定。引起pH值變化的原因較多，例如雖然釀酒酵母在發酵期間生成的產物主要是酒精，但葡萄糖還可以通過戊糖磷酸途徑產生乳酸和檸檬酸等有機酸[16]，某些雜菌生產繁殖也會帶來少量的乳酸和醋酸；少量二氧化碳氣體溶解在發酵液中也會使得其pH值降低[17]。在發酵過程中，發酵液的pH值變化幅度較小，這是因為香蕉果酒可作為一種緩沖溶液，保持著較好的酸性環境，減少雜菌污染的可能性。

將圖3和圖1對比分析發現，當酵母活動最旺盛時（3 d～4 d），發酵液的pH值達到最小值，這和謝小花等[17]的研究結果相似。這可能是因為酵母在主發酵過程中積累了乙酸，酵母生命活動越旺盛，乙酸含量也就越高。乙酸是由乙醇氧化生成的產物，是酵母產生的主要酸性物質，給果酒風味帶來負面的影響，其含量可以作為衡量原材料是否干凈衛生、發酵過程清潔度是否達標的重要指標之一[18]。由于乙酸可以作為誘導物引起細胞程序性死亡，導致酵母的生命活動受到抑制，且它本身也可以吸附和絮凝部分酸性物質[19]，所以pH值略有波動，小幅度上升后最終趨于穩定。

2.4 香蕉果酒發酵過程中還原糖含量的變化

糖分是酒精發酵重要的控制參數，是酒精發酵重要的營養物質，其含量決定了果酒的酒精度且影響果酒的口感，通過檢測發酵過程中還原糖的含量的變化可以判斷發酵過程是否正常。香蕉果酒發酵期間還原糖的變化見圖4。

圖4 香蕉果酒發酵期間還原糖含量的變化Fig.4 Changes in reducing sugar content during fermentation of banana wine

由圖4可知，香蕉果酒還原糖在發酵的1 d～2 d呈上升趨勢，可能是因為白砂糖在酵母中的蔗糖酶作用下，轉化形成了葡萄糖和果糖，之后還原糖開始下降，在第3天下降速度最快，表明了此時酵母生命活動最劇烈，耗糖能力最強，發酵液中進行劇烈的各類化學反應。到第8天，還原糖變化幅度變小，逐漸趨于穩定，這是因為發酵液中的大部分糖分已被酵母消耗，且酵母前8 d發酵產生的代謝產物抑制了酵母的代謝動力，分解糖分的能力下降。

2.5 香蕉果酒發酵過程中總糖含量的變化

香蕉果酒發酵期間總糖的變化見圖5。

圖5 香蕉果酒發酵期間總糖含量的變化Fig.5 Changes in total sugar content during fermentation of banana wine

總糖對果酒口感風味、色澤和穩定性等性質起著至關重要的作用[19]。在發酵的第2天總糖含量最高，這是因為發酵的第1天加入的白砂糖在發酵液中分解產生了單糖類化合物。之后總糖含量開始下降，在第3天變化最劇烈，由18.59 g/100 g降到了9.70 g/100 g，下降率達47.82%，之后下降速度緩慢，從發酵的第8天開始，總糖含量趨于穩定，香蕉果酒發酵結束時，總糖含量為3.33 g/100 g?？偺窃诘?天開始逐漸下降，可能是因為總糖和香蕉果酒中的蛋白質、單寧等物質形成不溶性的復合物。

2.6 香蕉果酒發酵過程中總多酚含量的變化

香蕉果酒發酵過程中總多酚含量與發酵時間的關系如圖6所示。

圖6 香蕉果酒發酵期間總多酚含量的變化Fig.6 Changes in total phenolic content during fermentation of banana wine

隨著香蕉果酒發酵時間的增加，總多酚整體呈現先下降后上升并趨于穩定的趨勢，發酵結束時，香蕉果酒的總多酚含量為0.122 g/L，比香蕉原汁提高了1.1倍?？偠喾釉谇捌谙陆悼赡苁且驗閯傞_始進行發酵時，發酵罐中存在的氧氣與多酚發生了氧化反應，也有可能是部分多酚和單寧類物質發生了聚合反應[20]。之后總多酚含量上升則有可能是隨著發酵進行，酒精度不斷積累，有利于多酚浸溶在發酵液中。在第4天總多酚含量略有上升，可能是某些單體酚類化合物含量增加引起的。引起多酚類化合物含量下降的原因有很多，其機理大多數是通過多酚化合物中的多元氫鍵和疏水鍵與總糖、蛋白質和生物堿等結合[21]。

2.7 香蕉果酒發酵過程中總黃酮含量的變化

黃酮類物質包括黃酮、異黃酮、二氫黃酮、查爾酮和黃酮醇、二氫黃酮醇等化合物，具有抗癌、抗氧化、抗衰老等功效作用，其含量的高低體現了發酵果酒的營養和保健價值。香蕉果酒發酵期間總黃酮含量的變化見圖7。

圖7 香蕉果酒發酵期間總黃酮含量的變化Fig.7 Changes in total flavonoid content during the fermentation of banana wine

由圖7可知，在香蕉果酒發酵期間，總黃酮含量變化幅度較小，其含量均在0.083 1 g/L至0.116 6 g/L間。由于黃酮的穩定性較差，易受自然光、pH值、還原劑等因素影響，且在主發酵期間，發酵液中的酶促反應、非酶促褐變和氧化反應都有可能對總黃酮含量有較大的影響，黃酮類物質在發酵罐缺氧環境后，氧化反應可能已經停止了，發酵液中更可能進行可逆的聚合或縮合反應[22]，使得總黃酮含量在后期波動較大。

2.8 香蕉果酒發酵過程中氨基酸含量的變化

氨基酸是果酒中重要的營養與呈味物質[23]。本次試驗共檢測出17種氨基酸（種類及含量見表1），包括除色氨酸外的其它所有必需氨基酸。

表1 香蕉果酒中氨基酸含量測定Table 1 The evaluation of amino acid content in banana wine

酵母菌在發酵過程中代謝消耗氨基酸，例如酵母在發酵過程中代謝氨基酸產生高級醇[24]，適量的高級醇能賦予果酒特有的醇香[25]。香蕉果酒中主要的氨基酸為組氨酸，在果酒中的含量最高為106 mg/L。

隨著果酒發酵的進行，香蕉果酒中氨基酸含量均呈下降趨勢，含量最高的是組氨酸，占總氨基酸量的36.31%，另外幾種含量較高的氨基酸是蘇氨酸（14.89%）、門冬氨酸（9.09%）、亮氨酸（6.69%）、絲氨酸（6.63%）、精氨酸（5.73%）、賴氨酸（5.22%）。

2.9 香蕉果酒發酵過程中有機酸含量的變化

果酒中有機酸部分來源于果實（如酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等），部分來源于酒精發酵、乙酸或蘋果酸-乳酸發酵（如乳酸、乙酸、琥珀酸等）。果酒中有機酸含量不僅對果酒風味、口味和色澤的平衡有重要作用，而且也影響果酒中各類物質的化學平衡、pH值，最終對果酒的品質產生影響[8]。

在香蕉果酒中，共檢測到7種有機酸（見表2）。

表2 香蕉果酒中有機酸含量測定Table 2 The evaluation of organic acid content in banana wine

其中蘋果酸、檸檬酸、乳酸含量較高，是香蕉果酒發酵過程中主要的有機酸，發酵結束后，果酒中蘋果酸含量達到5.50 g/L，占總有機酸含量的26.10%；乳酸含量達6.20 g/L，占總有機酸含量的29.42%；檸檬酸含量為2.90 g/L，占總有機酸含量的13.76%。醋酸的變化較為明顯在前期較為明顯的上升之后在第4天開始迅速下降，直至含量為0；草酸是一種最簡單的二元羧酸，在植物體內廣泛存在，在果酒發酵過程中，草酸含量呈現緩慢下降趨勢，后期趨于穩定，一般情況下在啤酒中草酸含量要求小于15 mg/L[26]，香蕉酒中草酸濃度偏高，原因有可能與原料有關系，也有可能是設備沒有清洗干凈；酒石酸含量先下降再上升，之后保持穩定；檸檬酸具有清爽的口感[27]，在前發酵過程中呈現先下降后緩慢上升并趨于穩定狀態；檸檬酸在酒精發酵過程中產生，繼酒精發酵后的蘋果酸-乳酸發酵中，蘋果酸可被轉化成酒精或乳酸[28]，蘋果酸含量在顯著下降后保持平穩狀態；隨著發酵進行，乳酸含量先減少后顯著增加，可能是由于菌株通過己糖-磷酸途徑將生成的5-磷酸-核酮糖裂解為3-磷酸甘油醛，再通過糖酵解途徑（embden-eyerhof-parnas pathway，EMP）生成丙酮酸并還原成乳酸；琥珀酸是主要來自糖分子的發酵作用，是酒精發酵正常發酵產物，所以琥珀酸含量在發酵過程中顯著上升[29]。

3 結論

本試驗以香蕉為原料，在低溫（20±3）℃的條件下發酵得到香蕉果酒，通過測定發酵過程中酒精度、糖度、吸光度、pH值、還原糖、總多酚和總黃酮等變化情況，分析其在發酵過程中的變化規律，評價香蕉果酒的質量。結果表明，在發酵過程中香蕉果酒的主要成分的變化存在一定的規律，發酵11 d的香蕉果酒最終達到12.11%vol的酒精度，糖度、還原糖含量隨著酒精度的上升而減少；在發酵前4 d，發酵液的吸光度呈上升趨勢，吸光度達到0.24后出現下降趨勢，在還原糖下降速度最快時，pH值也出現了最小值4.2；總糖含量在發酵的第2天開始逐漸下降，在第3天變化最劇烈；在果酒發酵期間，總黃酮含量變化幅度較小；總多酚含量整體呈現先下降后上升至后期趨于穩定的趨勢；氨基酸含量均呈下降趨勢，含量最高的是組氨酸（106 mg/L）；有機酸中蘋果酸、檸檬酸、乳酸含量較高，變化較明顯。