黃果茄總黃酮的提取工藝優(yōu)化與體外抗氧化活性研究

李學(xué)玲，許苑南，龍佳敏，張建強，陳梅，*

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650504；2.普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南普洱665000）

黃果茄（Solanum xanthocarpum Schrad.et Wendl）為茄科、茄屬植物，是多年生野生植物。主要分布于我國的福建、海南、廣西、四川、云南等地，黃果茄的果實、種子及根均可入藥，具有清熱利濕、活血化瘀和止痛的功效。目前，國內(nèi)外對黃果茄總黃酮的提取工藝及體外抗氧化活性的研究鮮見報道。

閆曉慧等[1]采用甲醇回流的方法得到黃果茄提取物，對其進(jìn)行了抗煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）活性研究，結(jié)果顯示具有一定的抗病毒活性，因此推測黃果茄中可能含有抗TMV的活性物質(zhì)；徐興建等[2]通過探究黃果茄提取物對不同貝類的生物效應(yīng)，表明黃果茄提取物是一種劑量低、效果好且很有潛力的植物滅螺劑；魏風(fēng)華等[3]通過一系列試驗，探究黃果茄提取物的滅螺效果，并進(jìn)行了魚類和大鼠急性毒性實驗，得出黃果茄提取物是一種劑量低、效果好且對魚類和大鼠毒性較低的植物滅螺劑；李娟娟等[4]提取和分離了黃果茄果實原粉中有效成分，得出黃果茄果實原粉中含有生物堿，它能有效抑制并殺死釘螺并且對魚類毒性不大，是一種效果好且低毒的滅螺劑；余蔚等[5]采用正交試驗法，以黃果茄果實中生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，優(yōu)化黃果茄果實中生物堿的提取工藝條件。

Josekutty等[6]研究發(fā)現(xiàn)從黃果茄中提取的有效成分對貓、犬的心肌有增強收縮作用；Dewangan等[7]用乙醇浸提黃果茄果實得到的提取物中被鑒定出重要的次生代謝產(chǎn)物生物堿、糖苷、皂苷、碳水化合物、單寧、酚類化合物、蛋白質(zhì)和脂肪。Baskar Kathirvelu等[8]得出黃果茄對棉鈴蟲具有毒性作用。Parmar Komal M等[9]研究表明黃果茄對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合具有很好的效果。

本試驗采用超聲波輔助提取黃果茄中總黃酮，通過Al（NO3）3-NaNO2顯色法測定黃果茄總黃酮含量，設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化黃果茄總黃酮提取工藝，通過顯色反應(yīng)可以對黃酮類化合物的種類及結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推測，通過測定總黃酮對DPPH·和·OH的清除率以及總抗氧化能力的方法評價其體外抗氧化活性，為黃果茄的藥用開發(fā)提供試驗研究基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

黃果茄：采于云南省紅河州個舊市卡房鎮(zhèn)村邊、路旁，晾曬至干，將曬干的黃果茄置于溫度為60℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干，冷卻至30℃，粉碎，過篩，將其裝入密封袋低溫避光保存。

1.2 試劑

無水乙醇、氫氧化鈉、抗壞血酸、亞硝酸鈉、水楊酸、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硝酸鋁（分析純）：北京康普匯維科技有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；過氧化氫（分析純）：重慶創(chuàng)導(dǎo)化工有限公司；三氯化鐵（分析純）：上海展云化工有限公司；鉬酸銨（分析純）：天津市化學(xué)試劑四廠；DPPH、蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品）：Acros公司。

1.3 儀器和設(shè)備

UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；WJX-100高速多功能粉碎機：上海緣沃工貿(mào)有限公司；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：河南省豫華儀器有限公司；DHG-9245A鼓風(fēng)干燥箱：江蘇同君儀器科技有限公司；FA3204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；DLAB移液器：大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

2 方法

2.1 提取工藝研究

2.1.1 試驗設(shè)計

2.1.1.1 單因素試驗設(shè)計

以黃果茄總黃酮提取率為考察指標(biāo)，分別探討提取時間[10、20、30、40、50、60 min，固定料液比 1 ∶50（g/mL）、溫度 30℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%]、料液比[1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），固定提取時間30min、溫度30℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%]、溫度[30、40、50、60、70、80 ℃，固定提取時間 30 min、料液比 1∶60（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù) 30%]、乙醇體積分?jǐn)?shù)[30%、40%、50%、60%、70%、80%，固定提取時間30 min、料液比 1 ∶60（g/mL）、溫度 50℃]對黃果茄總黃酮提取率的影響。在相同條件下結(jié)果平行測定3次，取平均值。

2.1.1.2 正交試驗優(yōu)化及黃果茄總黃酮含量的測定

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化黃果茄總黃酮的最佳提取工藝，所有試驗平行測定3次[10]。正交優(yōu)化分析出黃果茄總黃酮的最佳提取工藝，并在最佳工藝條件下測定黃果茄中總黃酮含量，驗證優(yōu)化試驗的合理性。

2.1.2 試驗方法

2.1.2.1 測定方法原理

黃酮化合物與亞硝酸鈉發(fā)生氧化還原反應(yīng)，然后與鋁離子結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，氫氧化鈉可使其顯色，在可見光區(qū)處有特征吸收峰，其吸光度值與總黃酮質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系[11]。

2.1.2.2 黃果茄供試品溶液的制備

稱取1.0 g黃果茄粉末于不同試驗條件下通過超聲波輔助對黃果茄總黃酮進(jìn)行提取，趁熱抽濾，定容，得供試品溶液。

2.1.2.3 黃果茄提取液中黃酮類化合物的鑒定

參考文獻(xiàn)[12]采用氫氧化鈉法、濃氨水法、三氯化鐵法和鹽酸-鎂粉法，通過觀察其顏色變化推測黃果茄提取液中黃酮類化合物的種類和結(jié)構(gòu)。

2.1.2.4 檢測波長的選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，加入80%乙醇溶解，定容至100 mL，得0.20 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

采用Al（NO3）3-NaNO2顯色法[13]，配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以不加蘆丁標(biāo)液的溶液為參比，在300 nm～700 nm范圍內(nèi)掃描，檢測最大吸收峰，確定出最佳檢測波長。并在最佳檢測波長條件下檢測系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A。以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過軟件Origin 9.0得到線性回歸方程。

2.1.2.5 黃果茄總黃酮含量測定方法

準(zhǔn)確移取供試品樣液1.00 mL于10 mL容量瓶中，按2.1.2.4的方法加入相同劑量相同種類的試劑，測定其吸光度，利用線性回歸方程計算出供試品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，然后按下列公式計算出黃果茄總黃酮提取率。總黃酮提取率計算公式為：

式中：C為供試品樣液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為供試品樣液總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為黃果茄粉末質(zhì)量，g。

2.2 黃果茄總黃酮體外抗氧化活性研究

2.2.1 ·OH清除率的測定

根據(jù)寇亮等[14]的測定方法，稍作改動。取5個10 mL的容量瓶并編號，準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的黃果茄樣品溶液各1.00 mL于相應(yīng)編號的容量瓶中，按順序加入1.00mL5mmol/mL H2O2溶液、2.00 mL 5 mmol/mL FeSO4溶液和5.00 mL 5 mmol/mL水楊酸乙醇溶液，蒸餾水定容至刻度線，搖勻，將容量瓶置于溫度為37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，于510 nm處測定其吸光度值A(chǔ)x。另取5個10 mL的容量瓶并編號，以不加入H2O2溶液作為試驗對照組，其余按照上述步驟操作，測定其吸光度值A(chǔ)x0。再取一個10 mL的容量瓶，以不加黃果茄總黃酮樣品溶液作為空白對照，其余操作同上，測定其吸光度值A(chǔ)0。同時，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽性對照。按以下公式計算黃果茄總黃酮對·OH的清除率：

式中：Ax是樣品組吸光度值；Ax0是試驗對照組吸光度值；A0是空白組溶液的吸光度值。

2.2.2 DPPH·的清除率的測定

參照王曉林等[15]的測定方法，稍作改動。用電子天平精確稱取10.0 mg DPPH于燒杯中，用無水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，充分搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其置于暗處備用。取5個10 mL的容量瓶并編號，準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的黃果茄樣品溶液各2.00 mL于相應(yīng)編號的容量瓶中，加入2.00 mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，用無水乙醇定容，避光放置30 min后，于517 nm波長下測定吸光度值A(chǔ)x。另外取5個10 mL的容量瓶并編號，用無水乙醇代替DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照組，其余按照上述步驟操作，測定其吸光度值A(chǔ)x0。再另取一個10 mL容量瓶，不加黃果茄樣品溶液，其余操作同上，測定其吸光度值A(chǔ)0。同時，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽性對照。按以下公式計算黃果茄總黃酮對DPPH·的清除率：

式中：Ax為樣品組吸光度值；Ax0為試驗對照組吸光度值；A0為空白組溶液的吸光度值。

2.2.3 總抗氧化能力測定

參照曹旭等[16-17]的測定方法，稍作改動。取5個10 mL的容量瓶并編號，準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的黃果茄樣品溶液各2.00 mL于相應(yīng)編號的容量瓶中，依次加入2.50 mL 0.6 mol/mL硫酸、2.50 mL 28 mmol/mL磷酸氫二鈉溶液和2.50 mL 4 mmol/mL的鉬酸銨溶液，搖勻，將其置于溫度為95℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)90 min，于695 nm處測定其吸光度值A(chǔ)。另外取一個10 mL的容量瓶，以2.00 mL無水乙醇溶劑代替樣品液作為參比溶液。同時，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽性對照，與黃果茄總黃酮的總抗氧化能力進(jìn)行比較。吸光度值越大表示黃果茄總黃酮的還原能力越強，即抗氧化能力越強，因此，吸光度值可作為評價總抗氧化能力大小的指標(biāo)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

全文涉及的試驗數(shù)據(jù)結(jié)果處理采用Origin9.0軟件統(tǒng)計計算并作圖，工藝優(yōu)化采用L9（34）正交優(yōu)化分析方法。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測波長的確定

檢測波長的測定結(jié)果見圖1。

圖1 檢測波長的確定Fig.1 Determination of detection wavelength

由圖1可知，測定溶液在501 nm處出現(xiàn)峰值，因此確定黃酮類化合物的檢測波長為501 nm。

3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果見圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.010 8x+0.001 5，R2=0.999 7。測定范圍內(nèi)，線性較好，在此區(qū)間內(nèi)蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度呈線性增長。

3.3 黃果茄提取液中黃酮類化合物的鑒定結(jié)果

黃果茄提取液中黃酮類化合物的鑒定結(jié)果見表1。

表1 黃酮類化合物的顏色反應(yīng)Table 1 Color reaction results of the flavonoids compound

由此可以初步推斷，黃果茄提取液中總黃酮主要為黃酮類、二氫黃酮類、查爾酮類和異黃酮類，且化合物中可能含有游離的酚羥基。由于表1所列的反應(yīng)顏色，只是某類黃酮體中大多數(shù)化合物所具有的共同顏色，要明確黃果茄提取液中的具體黃酮成分仍需做進(jìn)一步的鑒定[18]。

3.4 單因素的試驗結(jié)果

3.4.1 提取時間對總黃酮提取率的影響

提取時間對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，隨著提取時間的增加，黃果茄總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，最佳提取時間為30 min，之后總黃酮提取率逐漸下降。其原因可能是：隨著提取時間的增加，黃果茄中的總黃酮不斷溶于乙醇溶液中，提取率不斷升高，當(dāng)總黃酮全部溶出后，較長的提取時間可能導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)發(fā)生降解，提取率下降[19]。因此選取提取時間30 min為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.4.2 料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，隨著溶劑體積不斷增大，黃果茄總黃酮提取率不斷增大，最佳料液比為1∶60（g/mL），之后提取率趨于平緩。因此選取料液比1∶60（g/mL）為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.4.3 溫度對總黃酮提取率的影響

溫度對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，黃果茄總黃酮提取率隨溫度升高先增大后減少，超聲溫度50℃為最佳，之后總黃酮提取率顯著下降。其原因可能是：溫度越高分子運動的速率越快，從而使黃酮類物質(zhì)更易溶于溶劑中，可是溫度過高會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)及生物活性，還會增加其它雜質(zhì)的析出，導(dǎo)致提取率急劇下降[20]。因此，選取提取溫度50℃為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction rate

由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大，黃果茄總黃酮提取率先增大后減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時總黃酮提取率最佳，之后總黃酮提取率顯著下降。其原因可能是：乙醇溶液有利于黃酮類化合物溶出，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，黃果茄中的黃酮類物質(zhì)更容易溶出。但是，過大的乙醇體積分?jǐn)?shù)會使大分子物質(zhì)發(fā)生凝聚而使溶液變得濃稠，降低總黃酮的溶出率。因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.5 正交試驗結(jié)果

L9（34）正交試驗因素水平表見表2。試驗設(shè)計及黃果茄總黃酮提取率的結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experimental

通過極差分析可以看出，各因素對黃果茄總黃酮提取率的影響程度為A>B>C>D，即時間是影響黃果茄總黃酮提取率的主要因素，其次是料液比、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)。其最佳提取工藝條件為A3B3C2D2，即提取時間 40 min，料液比 1 ∶70（g/mL），溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。在此最佳提取工藝條件重復(fù)試驗3次，測得黃果茄總黃酮提取率為4.35%。其中A3B3C2D1為9組中的實際最優(yōu)組合，在該工藝條件下再次重復(fù)試驗3次，測得黃果茄總黃酮提取率為4.28%。因此，確定黃果茄總黃酮的最佳提取工藝條件組合為A3B3C2D2。

3.6 黃果茄總黃酮體外抗氧化活性研究

3.6.1 黃果茄總黃酮對·OH的清除效果

黃果茄總黃酮對·OH的清除效果見圖7。

圖7 總黃酮和VC對·OH的清除作用Fig.7 Hydroxyl radical scavenging effects of total flavonoids and VC

由圖7可知，隨著黃果茄總黃酮質(zhì)量濃度的增加，對·OH清除能力逐漸增強，質(zhì)量濃度超過100 μg/mL后，清除率增加趨勢緩慢。在質(zhì)量濃度為50 μg/mL～130 μg/mL的范圍內(nèi)時，相同質(zhì)量濃度的VC溶液的清除能力小于黃果茄總黃酮提取液，當(dāng)質(zhì)量濃度超過130 μg/mL時，VC對·OH的清除能力強于黃果茄總黃酮提取液。

3.6.2 黃果茄總黃酮對DPPH·的清除效果

黃果茄總黃酮對DPPH·的清除效果見圖8。

圖8 總黃酮和VC對DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH radical scavenging effects of total flavonoids and VC

由圖8可知，隨著黃果茄總黃酮質(zhì)量濃度的不斷增加，對DPPH·清除能力逐漸增強，當(dāng)質(zhì)量濃度大于150 μg/mL時，清除率不再有明顯的增大。VC對DPPH自由基有著較強的清除能力，相同質(zhì)量濃度下，VC的清除能力始終強于黃果茄總黃酮，且VC溶液質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，清除率就已經(jīng)達(dá)到90%以上，之后雖然質(zhì)量濃度不斷增加，但清除率不再較大幅度地增加。

3.6.3 黃果茄總黃酮的總抗氧化能力測定結(jié)果

黃果茄總黃酮的總抗氧化能力測定結(jié)果見圖9。

圖9 總黃酮和VC的總抗氧化能力的測定Fig.9 Determination of total antioxidant activity of total flavonoids and VC

由圖9可知，VC和黃果茄總黃酮的總抗氧化能力隨質(zhì)量濃度的增加而不斷增強，兩者之間呈線性關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，黃果茄總黃酮與VC的總抗氧化能力相當(dāng)，而質(zhì)量濃度超過50 μg/mL后，VC的總抗氧化能力明顯強于黃果茄總黃酮。

4 結(jié)論

本試驗選擇超聲波輔助提取方法，乙醇為提取溶劑，對黃果茄總黃酮的提取工藝、種類及結(jié)構(gòu)的鑒定及體外抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)研究。通過一系列顯色反應(yīng)，初步推斷黃果茄提取液中黃酮類化合物主要為黃酮類、二氫黃酮類、查爾酮類和異黃酮類。探討了提取時間、料液比、溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃果茄總黃酮提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，得到提取時間40 min，料液比1∶70（g/mL），溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為黃果茄總黃酮的最佳提取工藝條件。在此條件下，黃果茄總黃酮提取率可達(dá)4.35%。最后，通過探究黃果茄總黃酮對·OH、DPPH·的清除率及總抗氧化能力，說明在受測范圍內(nèi)，黃果茄總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。目前，對黃果茄的化學(xué)成分研究報道甚少，物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，難以確定黃果茄中主要的活性成分。本次研究優(yōu)化了黃果茄總黃酮的提取工藝，初步推斷黃酮類化合物的類型，并探究其體外抗氧化活性，對后續(xù)黃果茄的化學(xué)成分提取分離和抗病機制研究具有一定的參考價值。