佐劑或遞送載體與魚類疫苗的免疫途徑綜述*

張娜，吳允昆

（福建師范大學，福建 福州 350117）

2014 年，水產養殖在為人類提供食物方面的貢獻首次超過了野生魚類[1]。由于營養市場對魚類食品的需求量增加，養魚業的重要性日益提高且正經歷著產業繁榮。但是，大多數食用魚類通常在擁擠的環境中生長，因而很容易受到細菌、病毒的感染，這容易造成養殖業巨大的經濟損失。因此，魚類疾病防治被越來越多的人關注。

傳統上，抗生素已被廣泛應用于預防和治療水產疾病，然而，濫用抗生素成為了突出問題。抗生素對疾病的治療一方面會產生抗性菌株，另一方面也引起了人們對環境污染和消費者安全的關注，即消費者越來越關注魚肉中的藥物殘留問題。因此，人們開始重視更具有安全性的魚類疫苗的運用。

魚類雖然是低級脊椎動物，但它具有較為完善的免疫系統[2]。早在20世紀30年代就有報道稱魚類具有免疫應答反應，因此，疫苗被認為是最理想的預防魚類疾病的生物制劑[3]。1942年，Duff首次報道了殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)滅活疫苗不僅能有效保護魚體，還能刺激機體產生相應抗體[4]。

目前，用于魚類抗傳染性病原體的疫苗可大致分為傳統疫苗和現代疫苗。前者包括滅活疫苗和減毒疫苗，后者包括重組技術疫苗、合成肽疫苗以及DNA疫苗[5,6]。傳統疫苗通常比現代疫苗更有效，傳統疫苗的保護作用是由脂多糖、脂蛋白、復雜多糖以及蛋白質組成的多種抗原組合介導的[7-9]。保護作用引發了對佐劑的思考，疫苗可以通過添加佐劑來增強免疫效果，以多種天然或合成生物材料為代表的現代化疫苗遞送系統以及佐劑正在得到越來越多的研究，例如，殼聚糖、海藻酸鹽、脂質體、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)和碳納米管等。硬骨魚的皮膚和腸道與其黏膜免疫力直接相關，并在免疫防御中起著非常重要的作用[10]，佐劑和遞送系統的添加使得疫苗能夠更充分地接觸魚的黏膜組織。

魚疫苗主要通過3種途徑施用，即注射、浸泡、口服。本文綜述和討論了疫苗的3種免疫途徑各自存在的問題，以及疫苗如何對佐劑或載體合理選擇，為高效施用疫苗提供了參考思路。

1 佐劑和遞送載體

疫苗是一種安全高效的預防疾病的生物制品。但有時疫苗效果不如預期，佐劑是一種能改善疫苗的適應性和保護性反應的物質，其本身不具有抗原性質。佐劑促進免疫應答的早期發作，調節適應性和非特異性免疫，并改善黏膜表面對抗原的吸收，以誘導延長免疫力，因此需要使用佐劑來優化這些疫苗的效果。佐劑包括油包水型乳劑、細胞微生物組分和植物提取物[11,12]等。研究證明，佐劑與疫苗結合確實能產生高效疫苗[13]，而且佐劑已經在魚疫苗中使用了很長時間。例如，Montanide IMS 1312 VG油佐劑與病毒性出血性敗血病(VHS)病毒混合的浸泡疫苗在橄欖比目魚(Paralichthys olivaceus)中具有很高的保護作用[14]。Boesenbergia pandurata提取物和細菌滅活疫苗以1∶1的比例均勻混合，混合疫苗增強了羅非魚的免疫系統對疾病的抵抗能力[15]。

納米技術的遞送載體已在疫苗開發中廣泛應用。Vinay等[16]發現納米疫苗的新制劑能有效地和選擇性地將抗原遞送至合適的位點，為抗原提供穩定性并可以充當載體。Tafalla等[17]發現遞送載體能夠改善抗原通過鰓組織，皮膚和腸道的吸附，并促進了它們在淋巴組織中的保留和緩釋。例如，單壁碳納米管就是優良的納米級載體，因為碳納米管具有突破皮膚屏障的能力，可以高效地將疫苗運輸到魚體內，并在魚體中將疫苗釋放引起免疫反應[18]。納米顆粒載體具有佐劑效果的解釋是，1至100 nm的納米顆?？梢詡鬟f到淋巴結，它們可以很容易地被樹突狀細胞內在化并在疫苗接種部位保留很長的時間[19]。納米顆粒極小的尺寸和大的比表面積使它們易于通過大多數生物膜而不會引起變形，有助于疫苗有效吸收[20]。因此，納米級遞送載體在魚類疫苗中的應用越來越受到重視，不同的免疫途徑與合適的納米顆粒組合能有效地提高疫苗的免疫效果。

2 免疫途徑

2.1 注射疫苗

注射疫苗是一種迄今為止對抗疾病十分有效的接種方法，因為注射免疫可以準確控制抗原的用量而對機體產生較高的免疫保護，并具有持久的免疫作用。幾乎任何種類的疫苗都可以通過注射途徑引起機體的免疫應答并對機體產生保護作用。鏈球菌病魚滅活疫苗是經腸胃外注射給藥，在受到病原體攻擊時對魚體產生保護作用[21]。連續體外傳代的減毒菌株通過注射免疫，疫苗顯示出顯著改善的穩定性和免疫原性，能對羅非魚產生一定的保護作用[22]。甚至亞單位疫苗、DNA疫苗等都可以通過注射直接免疫魚體。

在注射疫苗中添加佐劑能增強免疫效果，但是早期的佐劑會產生副作用對魚體造成傷害，新型佐劑則更安全、更高效。最近，Bwalya等[23]制備了含油佐劑的滅活自身疫苗，注射免疫后安全有效地保護羅非魚免受加維氏乳桿菌感染，而且沒有明顯的副作用?，F在，越來越多以納米級顆粒為主的遞送系統應用到疫苗中，它們為注射疫苗開拓了更廣闊的前景。通過腹膜內注射由病毒的強毒重配株的外殼蛋白制成重組蛋白納米顆粒VNNV-CNP，結果顯示魚的頭腎中CD4和IgM上調，表明適應性全身反應被激活并在幼魚體內產生了特異性抗體應答[24]。病毒樣納米顆粒能自組裝成與天然病毒顆粒相同的完整三級結構，Wi等[25]發現病毒樣顆粒疫苗(VLP)經腹膜內注射施用引起魚高效的免疫應答，為魚類提供了針對神經壞死病毒攻擊的全面保護：100%的免疫魚得以幸存，而接種磷酸鹽緩沖鹽水的對照組魚只有37%的存活率。

然而，人工給大量的魚注射疫苗是費力、高成本的勞動，還會造成魚的應激反應，幼魚也因體型太小而無法通過注射接種疫苗。研究人員想到利用機械注射能降低注射免疫的難度，儀器自動注射相對于人工注射效率高，魚體的應激反應更小，更有利于魚體的健康[26]。但是，儀器設備成本高，對魚的體型也有要求，較難推廣使用，因此國內至今沒有普及商業化的魚類疫苗自動注射設備。

2.2 浸泡疫苗

浸泡免疫也是一種有效的疫苗接種方法。將魚浸入含有疫苗的水中時，環境中懸浮的抗原可能會被皮膚和鰓等吸收。皮膚和鰓上皮中的功能細胞將被激活，例如抗原呈遞細胞（巨噬細胞），吸收抗原并將其運輸到專門的組織中，在該組織中形成全身性免疫應答，并保護魚類免受病原體侵害。浸泡疫苗的優勢是可以對養殖的魚進行大面積的接種，但通過鰓和皮膚吸收抗原的效率有限，因此該方法的效力低下。為了提高浸泡免疫效果，有時候采用高滲透浸泡、超聲波浸泡等方法。通過牛血清白蛋白(BSA)對金魚的保護效果研究發現，高滲透浸泡僅需簡單浸泡方法抗原使用量的20%，而超聲波浸泡刺激皮膚傳導抗原的效果比高滲透浸泡更優，產生的抗體水平更高[27]。浸泡免疫不僅可以誘導機體產生黏膜免疫反應，還能產生系統免疫反應[28]。例如通過浸泡免疫，魚中相應的免疫因子表達均升高，被塔氏愛德華氏菌的強毒株感染后，浸泡免疫含有PLGA的疫苗組中觀察到了最高的相對存活率64.7%[29]。

浸泡免疫的時長對其免疫效果有較大影響。Moore等[30]的實驗結果表明，將魚在 BSA-PLGA微球中浸泡24 h后發現，低濃度長時間浸泡有助于提高免疫效果。將開發的納米材料作為疫苗載體，疫苗能在縮短疫苗免疫時間并提高抗原含量的同時，產生很好的免疫效果。例如，由單壁碳納米管作為載體，編碼傳染性脾腎壞死病毒的主要衣殼蛋白(MCP)基因制成亞單位疫苗(SWCNTs MCP)，功能化的單壁碳納米管作為疫苗載體可以提高魚中疫苗的含量，浸泡免疫魚30 min后發現，可以在魚中誘導強烈的針對染性脾腎壞死病毒的免疫保護反應[31]。水鏈球菌疫苗是用帶正電的殼聚糖包被帶負電的滅活細菌懸液來制備的黏膜粘附疫苗，還是一種分散在液體納米顆粒微乳液中的高濃度抗原的疫苗，這提高了疫苗的免疫原性和功效。用疫苗對羅非魚苗進行了30 min浸泡免疫，第2周檢測到保護性抗體，且羅非魚對病原體至少有3個月的抵抗力，攻毒后得出同等水平的未接種疫苗組和裸露疫苗組的存活率分別為10%和13%，疫苗組的存活率則為83%[32]。

出于養殖魚類生存環境的考慮，浸泡法對于大規模免疫很方便。但皮膚屏障和細胞膜選擇通透性，包括蛋白質和質粒在內的大多數生物大分子不容易進入魚體，這也是浸泡接種疫苗應用的障礙?，F代技術下的疫苗通過在制備過程中修飾合適的材料，已經在很大程度上解決了屏障問題并且保護了抗原。例如，碳納米管可以穿透皮膚屏障，通過受體介導的內吞作用進入細胞。 Zhao等[33]使用單壁碳納米管作為載體的DNA疫苗免疫魚，疫苗組存活率高達82.4%，裸DNA疫苗組存活率僅為54.2%，表明功能化的單壁碳納米管是一種有前途的浸入式DNA疫苗載體。

2.3 口服疫苗

口服疫苗已成為魚類疫苗接種的理想方法?？诜庖呤菍⒖乖惋暳匣旌?，通過投料或者口飼管插管，將疫苗通過主動攝食的方式引入魚體?？诜呙缭诮o藥途徑上具有很大優勢，可以避免魚的應激反應、省時省力，而且能通過黏膜接觸引起免疫反應，從而產生更好的免疫效果。但是，在口服疫苗的使用中，由于小腸中存在許多蛋白酶和其他酶，因此在細胞攝取抗原之前，劇烈的消化或失活常常阻礙了抗原的成功遞送。

為了防止胃腸道等的惡劣條件并控制大腸中蛋白質的運輸，我們課題組[34]設計了一種智能的PMMMA-PLGA二元殼。用PTRBL/Trx-SIP口服免疫后，在實驗羅非魚的抗血清中產生了高水平的特異性抗體IgM，并對魚體產生100%的保護作用。PMMMA-PLGA/Trx-SIP口服疫苗可將抗原靶向羅非魚的大腸，將抗原(FITC標記的Trx-SIP)遞送至脾臟和腎臟，PMMMA納米殼具有pH調節的羧基響應性溶脹和相變，可以保護PLGA納米顆粒免受胃和小腸消化的影響，從而繞過小腸中納米顆粒對細胞的選擇性吸收，然后釋放PLGA/抗原納米顆粒供在大腸中細胞攝取。這項關于PMMMA-PLGA PTRBL載體的研究證明，新型材料的開發使得口服疫苗具有更高實用性。

此外，還可利用基因敲除技術改造抗原，使魚用口服疫苗更安全。早期制備的口服減毒疫苗由于穩定性差，免疫反應較弱，免疫保護持續時間短，或生長速率低，限制應用[35]。Li等[36]發現羅非魚無乳鏈球菌減毒菌株YM001中D2片段的缺失是羅非魚鏈球菌失去毒性的主要原因，因此研究構建了親本強毒株HN016中D2片段缺失的Δ2突變體，并對其安全性、穩定性、免疫原性以及致病機理進行了評價。結果表明，Δ2突變體對羅非魚沒有致病性，并且在傳代50代后未觀察到強毒回復株，與YM001相比，Δ2突變體是無乳鏈球菌的一種有希望的、更好的減毒口服疫苗菌株。

現階段我們不僅要優化抗原，還需要把口服疫苗研究的重心放在現代技術上，制備、開發和應用更適合的疫苗遞送系統，以此得到高效的口服疫苗。遞送系統可以在結構上模擬抗原，引起機體免疫反應。Bacterial Ghost是非常有價值的無生命載體，BG是無生命的革蘭氏陰性細菌細胞膜，BG的生產過程不會使細菌的包膜或表面蛋白變性，也不會保留病原體相關的分子模式(PAMP)[37]。它們可以在一個或多個細胞位置攜帶外來抗原、核酸和藥物。它們易于生產以及無需冷藏即可進行存儲和加工及其出色的安全性(即使以高劑量給藥)，并且具有天然佐劑特性，還可利用BG及其同伴的相同表面受體來靶向特定的細胞和組織。因此，這是一種在水產養殖實踐中開發更有效口服給藥疫苗的出色技術[38]。同樣，病毒樣顆粒在表達系統中能自組裝成病毒固有結構，能被抗原呈遞細胞識別?？诜茱暦c胃外施用的病毒樣顆粒疫苗引起高效的免疫反應，口服疫苗給予全身激發抗體，并賦予抵抗病毒攻擊的保護性免疫力，經攻毒后57%的魚得以幸存[25]。

3 最適的免疫途徑

接種疫苗是預防水產養殖傳染病最有效的方法。而免疫途徑影響疫苗的效果，Li等[39]得出減毒活疫苗以口服、浸泡和注射的方式對尼羅羅非魚的相對保護率分別達到71.81%、67.22%和96.88%。Chien等[40]人在石斑魚中嘗試口服、浸泡、注射免疫3種不同的途徑，并經過攻毒后，魚的存活率為口服52.3%、浸泡81.9%、注射61.4%。可見，每種疫苗都有最高效的免疫途徑。添加佐劑也能影響免疫途徑的免疫效果，Hardi等[15]在疫苗中添加植物提取物為佐劑，浸泡法比口服法更好地提高了疫苗的效力。浸泡疫苗的存活率為83%～100%，口服為83%～87%。重組蛋白納米顆粒的遞送系統通過2種途徑免疫魚，在注射組中發生了實質性的特異性抗體擴增，注射魚的頭腎臟中CD4和IgM上調，表明適應性全身反應被激活，在口服組中腸道處表現出黏膜反應[24]。

還有研究發現，結合使用不同免疫途徑，同樣能提高魚的存活率。Kole等[41]人對橄欖比目魚使用了2種接種方案，首先通過浸泡對所有魚進行免疫，2周后用同樣劑量疫苗，一半的魚通過浸泡免疫，另一半通過口服免疫(摻入魚飼料中）。病原體攻擊后在浸泡/口服組中相對存活率73.3%，浸泡/浸泡組相對存活率為60%，而在另一項口服/口服組的試驗研究中，僅獲得了23.3%的相對存活率。因此，可以推斷出所采用的免疫策略有效地保護了滅活的病毒抗原。這表明可以嘗試不同的免疫途徑和組合以優化響應，為免疫途徑開拓了新思路。

4 展望

注射免疫具有劑量準確、產生免疫應答能力強、持續時間長的優點，多項實驗表明佐劑能提高和延長注射免疫應答，免疫次數少就能引起機體的免疫應答。但是同時，注射免疫的缺點顯而易見。注射不僅耗時耗力，而且對于體型較小或者在幼年時期就容易感染疾病的魚體而言，注射免疫不是最佳的接種途徑。注射也會損傷魚體，還伴隨著魚類會產生應激反應。隨著能夠穿透皮膚屏障的納米材料的應用，浸泡免疫相對注射免疫具有更加廣闊的前景?？诜呙鐚⑹墙陙淼难芯恐攸c，這是一種頗具優勢的免疫方式。

盡管由現代分子生物學發現的新抗原和疫苗呈指數增長，但安全有效的佐劑和遞送載體的匱乏是其應用的限制因素之一。大量的研究表明大部分納米顆粒的載體具有佐劑效果，可以不費力地遞送抗原、保護抗原免于變性降解，許多研究也證明了合適的佐劑和遞送系統能更有效地提高疫苗的作用。而利用不同的佐劑制備疫苗，確實能產生不同水平的免疫應答[42]。通過運用更合適的佐劑和遞送載體，疫苗效果能達到魚類疫苗商業化。相信在今后，更便利、低成本、高效應的疫苗將會通過更合適的接種途徑在經濟魚類中得到廣泛的應用。