非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進展

朱小甫，吳旭錦

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，咸陽市動物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000)

非洲豬瘟(ASF)的病原是非洲豬瘟病毒(ASFV)，該病傳播速度快，發(fā)病率、病死率高，對社會經(jīng)濟造成巨大影響，在我國動物防疫法中被列為一類動物疫病[1]。ASFV在分類上屬非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，典型二十面體結(jié)構(gòu)，大小約200nm，遺傳物質(zhì)為雙股線性DNA，堿基數(shù)170～190 kb[2]。由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，學(xué)界對其大多數(shù)蛋白結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚，亦無有效疫苗投入臨床應(yīng)用，在預(yù)防ASF方面面臨很多困難[3]。2018年8月，我國首例ASF出現(xiàn)在遼寧沈陽，疫情迅速蔓延全國，我國生豬產(chǎn)業(yè)損失慘重[4]。為盡快控制撲滅疫情，除了加快研發(fā)有效疫苗外，更為現(xiàn)實和重要的是依靠診斷技術(shù)做到早診斷、早撲殺感染動物，消除傳染源和疫點。總的來看，ASF診斷技術(shù)分為臨床與病理診斷、血清學(xué)方法和病原學(xué)方法三大類，現(xiàn)綜述如下，以期為診斷防控ASF提供參考。

1 臨床與病理診斷

ASF臨床表現(xiàn)與病毒毒力、感染劑量與途徑有關(guān)。最急性型表現(xiàn)為豬只無明顯臨床癥狀的突然死亡。急性型表現(xiàn)為高熱(40～41℃)，食欲不振，皮膚出血，先便秘后腹瀉帶血，死亡率極高。慢性型臨床癥狀溫和，主要表現(xiàn)為食欲減退，輕微發(fā)熱，精神差，有呼吸道癥狀，懷孕母豬流產(chǎn)[5]。病理變化上以急性型表現(xiàn)最為特征，脾臟顯著腫大，質(zhì)地變脆，色澤發(fā)黑，切面隆起有多量黑紅色液體流出。淋巴結(jié)腫大，表面有出血點或出血斑，切面呈花斑狀。有的病例中可見心包積水，心外膜內(nèi)膜有出血點。胸腔積水，肺臟水腫有淤血。腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)有出血點。肝臟、膽囊充血，腸道漿膜點狀或斑片狀出血，黏膜彌漫性出血。膀胱黏膜有點狀出血。病毒侵害中樞神經(jīng)引起腦膜點狀出血[6]。需要指出的是，以上癥狀與病變并不是ASF特有，豬瘟、高致病性豬藍耳病以及敗血性鏈球菌病等均有類似表現(xiàn)，因此依據(jù)癥狀與病變只能診斷為疑似病例，確診需要實驗室方法[7]。

2 病原學(xué)診斷

ASFV病原診斷技術(shù)有三類，即病毒分離、病毒抗原檢測和基因組DNA檢測。病原檢測適用范圍廣，在潛伏期、發(fā)病初期均可應(yīng)用。

2.1 病毒分離

OIE推薦ASF診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離，常用紅細(xì)胞吸附試驗(HAD)進行ASFV分離確診[8]。其原理是，如果豬的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞被ASFV感染，這些細(xì)胞就具有吸附豬紅細(xì)胞的能力。用疑似感染豬血清或病料處理液接種培養(yǎng)的原代白細(xì)胞進行HAD，或用感染豬外周血白細(xì)胞作“自動玫瑰花環(huán)”HAD。培養(yǎng)完成后鏡檢，發(fā)現(xiàn)在感染細(xì)胞上有紅細(xì)胞吸附即可判定為陽性。ASFV抗體可阻斷該病毒吸附紅細(xì)胞，據(jù)此設(shè)計的紅細(xì)胞吸附抑制試驗(HADI)用來測定抗體水平或測試不同分離株是否在抗原性上存在差異[9]。HAD技術(shù)的缺點是耗時長，操作復(fù)雜，需要借助其他檢測方法進行判定，不適合快速診斷。

2.2 熒光抗體檢測病毒抗原

熒光抗體法(FAT)檢測ASFV，用待檢組織作冰凍切片或壓印片，或在載玻片上涂開已接種的白細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀，干燥后浸入丙酮中固定，用熒光抗體染色后沖洗，在熒光顯微鏡下觀察，如果胞漿中發(fā)現(xiàn)特異性熒光，即判為陽性。FAT可用來檢測疑似病例組織中有無ASFV，也可用于確定無HAD現(xiàn)象的白細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在ASFV，即能鑒定無HAD能力的毒株。FAT還可鑒別CPE是由ASFV和其他病原、或有細(xì)胞毒性的接種物引起。但在檢測慢性感染病例時FAT靈敏度較低，可能是抗原抗體復(fù)合物干擾的結(jié)果[10]。

2.3 膠體金檢測病毒抗原

吳海濤等[11]用大腸桿菌表達ASFV P72蛋白，免疫兔制備高免血清，用雜交瘤細(xì)胞制備ASFV單抗，將上述ASFV多抗和單抗純化，在硝酸纖維素膜上包被SPA作為質(zhì)控線，包被ASFV多克隆抗體作為檢測線，制成檢測ASFV的試紙條。為了驗證試紙條的實用性與可靠性，測試抗原為兩種基因工程表達的ASFV P72蛋白，發(fā)現(xiàn)制備的試紙條在5～10 min內(nèi)可準(zhǔn)確識別兩種蛋白抗原，對兩種抗原的最低識別量分別為15 ng和21 ng。膠體金檢測操作簡單快捷，穩(wěn)定性好，檢測成本低，但只可定性不可定量，適用于ASFV初步篩查。

2.4 基因組DNA檢測

2.4.1 普通PCR技術(shù) PCR技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動了分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增病原核酸特異性片段診斷相應(yīng)的疫病成為實驗室常用技術(shù)手段，OIE官方推薦PCR作為ASFV檢測方法之一。PCR方法的優(yōu)點是快速、敏感，特異性好，不需要病毒分離即可快速診斷。吳憶春[12]以人工合成的ASFV VP73基因為模板，設(shè)計特異性引物，建立PCR方法并組裝成試劑盒，該試劑盒與常見的6種豬病毒、健康豬和蟬的基因組無交叉反應(yīng)，檢測重組質(zhì)粒敏感性極限為0.1 fg，與OIE推薦的引物敏感性相當(dāng)。楊吉飛等[13]根據(jù)ASFV VP72基因設(shè)計了檢測ASFV的PCR方法，與豬的13種常見病毒、細(xì)菌、衣原體核酸無交叉反應(yīng)，敏感性與OIE推薦方法類似，所建立的PCR方法能準(zhǔn)確擴增17個ASFV分離株的基因組，驗證了方法的有效性。Luo Y等[14]根據(jù)p72基因設(shè)計引物，用建立的PCR方法檢測了不同地區(qū)I、V、VIII、IX 4個基因型14個代表毒株，該方法比OIE的兩種PCR更為靈敏，檢測ASFV基因型更為全面。

2.4.2 多重PCR技術(shù) 多重PCR技術(shù)可以一次性檢測多種病原核酸，檢測效率高，節(jié)約試劑耗材成本，被廣泛應(yīng)用于動物疫病檢測。冷依伊等[15]針對水皰性口炎病毒、非洲豬瘟病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒和豬瘟病毒5種病原設(shè)計引物，建立了五重RT-PCR鑒別診斷方法，該方法對CSFV、PRV、ASFV、FMDV和VSV的核酸檢測極限分別為6.87×104拷貝·μL-1、8.82×103拷貝·μL-1、5.71拷貝·μL-1、4.32×102拷貝·μL-1和4.93×104拷貝·μL-1。張倩等[16]采用OIE推薦的ASFV檢測引物，再設(shè)計一對檢測豬瘟病毒的引物，建成了檢測這兩種病原的雙重PCR方法，該方法在一個反應(yīng)體系中同時擴增兩個不同病毒目的基因，檢測極限為100 pg的DNA，具有省時、快速的特點。

2.4.3 納米PCR技術(shù) 納米PCR是在普通PCR反應(yīng)體系中加入固體納米金屬顆粒，形成熱導(dǎo)性更強的納米流體，PCR反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)更快，可消除非特異性擴增，提高反應(yīng)的特異性和擴增產(chǎn)物產(chǎn)量[17]。崔尚金等[18]采用納米PCR方法檢測ASFV與其他7種常見豬病原，結(jié)果顯示僅ASFV能成功擴增，敏感性試驗表明，該方法檢測極限為43拷貝·μL-1，而普通PCR檢測極限為4.3×104拷貝·μL-1，納米PCR法靈敏度增加了1 000倍。

2.4.4 實時熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)采用熒光素標(biāo)記特異性核酸探針，或用熒光染料插入PCR雙鏈產(chǎn)物，通過熒光信號強弱變化實時監(jiān)控反應(yīng)過程，用軟件計算分析樣品模板濃度。qPCR不需要電泳成像，檢測過程簡化，且真正實現(xiàn)了絕對定量。李洪利等[19]根據(jù)p72基因序列設(shè)計熒光定量引物與探針，建立了qPCR方法，該方法檢測極限為10拷貝·μL-1。郭少平等[20]針對K205R基因設(shè)計并建立了qPCR檢測方法，提取豬肝組織DNA，摻入ASFV K205R基因重組質(zhì)粒作為模板，確定檢測效率，以O(shè)IE推薦的qPCR方法作為對照，試驗證實，建立的qPCR效率比OIE推薦方法要高。王建華等[21]針對ASFV CP530R基因和HP-PRRSV NSP2基因設(shè)計檢測引物與探針，建成一種二重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，該方法對ASFV和HP-PRRSV可特異性擴增，最低檢測極限分別為61拷貝·μL-1和41拷貝·μL-1，重復(fù)性試驗表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.5 環(huán)介導(dǎo)等溫PCR技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫PCR技術(shù)(LAMP)是一種基于鏈置換DNA聚合酶的恒溫核酸擴增方法，該方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，在63℃左右恒溫30～60min完成核酸擴增，不需要常規(guī)PCR的核酸模板變性、退火、延伸等循環(huán)過程，無需電泳成像，只要有簡單的恒溫設(shè)備即可完成，具有簡單、低成本、快速、特異的特點。王彩霞等[22]合成了ASFV P72全長基因，設(shè)計了環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增的內(nèi)、外引物，建成了LAMP診斷方法，該方法檢測下限為10拷貝/μL，特異性良好。楊吉飛等[23]根據(jù)ASFV P72基因設(shè)計LAMP檢測引物，對豬基因組、蜂基因組與已知的ASFV基因組進行檢測，結(jié)果僅ASFV基因組能擴增，豬與蜂的基因模板為陰性。王建昌等[24]建立了一種基于ASFV P72基因的重組酶聚合酶等溫擴增方法，在38℃恒溫0.5h即可有效擴增目的基因，以P72基因質(zhì)粒為模板，檢測極限達到200個拷貝，與OIE qPCR靈敏度一致，比OIE PCR方法高10倍，方法簡單快速，成本較低，是非洲豬瘟一線防控可靠的技術(shù)手段。

2.4.6 微滴數(shù)字PCR技術(shù) 微滴數(shù)字PCR(ddPCR)是一種全新的絕對定量技術(shù)，通過稀釋實現(xiàn)單個模板分子擴增，利用泊松分布原理和終點法PCR，通過軟件分析計算出模板濃度。ddPCR無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，低濃度模板也可精準(zhǔn)定量，該技術(shù)引起國內(nèi)外的高度關(guān)注和應(yīng)用。鄔旭龍等[25]設(shè)計并建立了ASFV qPCR和ddPCR檢測方法，評估了這兩種方法的特異性、靈敏性、重復(fù)性和線性關(guān)系，檢測了163份國內(nèi)外的血清和組織樣品，用ASFV ELISA試劑盒復(fù)檢了血清樣品，計算不同方法檢測符合率，結(jié)果建立的qPCR和ddPCR檢測方法有良好的線性關(guān)系，ddPCR靈敏度可達0.36個拷貝，靈敏度比qPCR高10倍。

2.4.7 交叉引物擴增-試紙條法 Gao Yao等[26]選擇ASFV基因的高保守區(qū)域，設(shè)計檢測引物與探針，探針用異硫氰酸熒光素和生物素標(biāo)記，同樣用異硫氰酸熒光素和生物素標(biāo)記CPA擴增產(chǎn)物的末端，在試紙條檢測線區(qū)域會形成膠體金-抗異硫氰酸熒光素抗體-擴增產(chǎn)物-抗生物素抗體偶聯(lián)復(fù)合物，檢測線處固定膠體金，陽性結(jié)果檢測線會顯示顏色變化，建成交叉引物擴增-診斷試紙聯(lián)合使用的檢測方法，該方法檢測下限為200拷貝·μL-1，試紙條重復(fù)性好，全血樣品檢測顯示與qPCR的符合率為97.8%。這種方法先通過交叉引物進行等溫PCR擴增，再用試紙條檢測產(chǎn)物，不需要儀器設(shè)備，實現(xiàn)現(xiàn)場快速診斷，適合現(xiàn)地檢測需求，應(yīng)用前景廣闊。

3 血清學(xué)診斷

3.1 ELISA檢測技術(shù)

龔振華等[27]參考非洲豬瘟病毒P54基因序列，通過人工合成P54基因，克隆至表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示，該質(zhì)粒可高效表達分子量約20.7 ku的P54蛋白，該蛋白具有可溶性，易于純化，能特異性識別ASFV陽性血清，ELISA試驗顯示，P54蛋白針對ASFV陽性血清和陰性血清的P/N值為1.67，結(jié)果證實用該蛋白建立的ELISA方法可用于非洲豬瘟抗體診斷。靳雯雯等[28]采用基因工程技術(shù)制備ASFV VP73蛋白，以此蛋白包被ELISA板，建立了間接ELISA測定ASFV抗體的方法，靈敏性測試表明，該方法可檢測到1 ∶2 560稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，與同類進口ELISA試劑盒相當(dāng)，特異性和重復(fù)性良好。董志珍等[29]以基因工程技術(shù)制備的ASFV P54蛋白免疫小鼠，制備ASFV單克隆抗體，制作成競爭ELISA檢測ASFV抗體的試劑盒，該方法特異性高，比間接免疫熒光法靈敏度高。

3.2 膠體金試紙檢測技術(shù)

張鑫宇等[30]原核表達了p54蛋白，用膠體金標(biāo)記蛋白，以玻璃纖維墊為載體，噴涂標(biāo)記蛋白，質(zhì)控線為抗p54多克隆抗體，檢測線為SPA，制成了檢測試紙條。該試紙條檢測抗體的靈敏度為200 ng·mL-1，檢測豬常見病毒抗體陽性血清均為陰性，提示試紙?zhí)禺愋愿摺?yīng)用試紙檢測141份豬血清樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于ASFV早期感染的診斷上，該試紙比OIE推薦的間接ELISA要好。以免疫印跡法為參照，在檢測疫區(qū)臨床陽性樣品上，該試紙條的符合率比OIE推薦的ELISA要高。試紙表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用效果，具有良好的開發(fā)前景。

3.3 量子點免疫層析試紙技術(shù)

林彥星等[31]利用軟件分析ASFV VP73蛋白的氨基酸序列，選擇優(yōu)勢抗原表位區(qū)域后合成多肽，將其偶聯(lián)上牛血清白蛋白，選取抗原性好的多肽作為檢測線包被抗原采用量子點標(biāo)記葡萄球菌蛋白A，抗葡萄球菌蛋白A的多克隆抗體作為質(zhì)控線的包被蛋白，制成了檢測ASFV抗體的量子點免疫層析試紙。試驗結(jié)果顯示，該試紙條特異性良好，與普通豬病陽性血清無交叉，同時用進口ELISA試劑盒檢測進行對比，結(jié)果完全符合。制成的試紙操作簡便，在ASFV抗體的現(xiàn)場檢測方面具有優(yōu)勢。

4 小結(jié)與展望

自ASF傳入我國以來，短時間對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大打擊，給社會生活造成了一定的影響。為了控制ASFV的蔓延傳播，急需短時、特異、準(zhǔn)確、方便的診斷手段。病毒分離是ASFV診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但分離鑒定需要較長時間，分離物需要輔助手段進行鑒定，因此只適合進行病原研究，不能用于快速診斷。PCR技術(shù)樣本來源多樣化，操作簡單快速，靈敏特異，適合快速診斷。熒光定量PCR是目前主要推廣使用的快速診斷方法，該方法能實時監(jiān)測反應(yīng)過程，對模板可絕對定量，但該方法易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，檢測中要嚴(yán)格設(shè)立對照，且對檢測環(huán)境和操作技術(shù)要求很高。環(huán)介導(dǎo)等溫PCR技術(shù)快速準(zhǔn)確，成本低，結(jié)果直觀，不需要特殊設(shè)備，適用于現(xiàn)場便攜式診斷，該方法缺點是低濃度模板單一溫度擴增會導(dǎo)致產(chǎn)生非特定產(chǎn)物，易形成氣溶膠污染造成假陽性。ELISA方法是國際貿(mào)易指定試驗方法，但該方法技術(shù)要求高，鑒定時程長，對儀器設(shè)備依賴性較大。目前急需現(xiàn)場快速診斷技術(shù)支持豬場現(xiàn)地篩查，為迅速控制疫情爭取時間。環(huán)介導(dǎo)等溫PCR技術(shù)和膠體金技術(shù)主要優(yōu)點就是耗時更短、不需要特殊設(shè)備即可進行，因而是重要的技術(shù)開發(fā)方向。需要指出的是，ASF診斷是防控的第一步，撲滅疫情需要在診斷的基礎(chǔ)上結(jié)合撲殺、消毒、限制病原傳播、生物安全等綜合措施，才能有效控制并達到消滅ASF的目的。