幽門螺桿菌生物膜的形成 致病性及其耐藥性

周杰挺 谷海瀛

作者單位：315211 寧波大學醫學院

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種革蘭氏陰性，微需氧的人類病原體，目前已證實Hp感染與多種胃十二指腸慢性疾病密切相關，包括慢性活動性胃炎，消化性潰瘍，萎縮性胃炎，黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌。據報道，世界上超過一半的人口受Hp感染，在發展中國家年齡＞50歲的人群中Hp感染率高達80%［1］，這給公眾健康帶來了巨大的負擔。自20世紀80年代發現Hp以來，對于Hp的研究主要集中在浮游態和非附著的生長方式上；然而，越來越多的證據表明Hp可以以一種被稱為生物膜的表面附著方式呈群落生長，這種生長模式有助于病原微生物在惡劣環境中的存活及抵抗抗生素的干預治療和宿主免疫系統的反應，從而延長感染時間，導致慢性感染［2］。目前，關于Hp生物膜的研究仍處于早期階段，其形成及其在致病中發揮的作用尚不明確，因此，本篇綜述將介紹近年來關于Hp生物膜形成相關分子機制及其生物膜致病作用的最新研究進展。

1 胃部幽門螺桿菌生物膜的形成

2006年，Carron等［3］使用掃描電子顯微鏡（SEM）首次觀察到致密成熟的Hp生物膜存在并附著于人胃黏膜活檢標本的上皮細胞上。近年來，Attaran B等［4］在小鼠模型中也證實了Hp生物膜的形成。他們使用SEM和多克隆抗Hp特異性免疫熒光抗體觀察到Hp在小鼠胃黏膜上形成了生物膜，表現出與在人類胃黏膜上一樣的潛力，由無定型細胞外基質包裹的球形細菌牢固地附著在上皮細胞上。而且Cammarota等［5］報道，對于有≥4次Hp根除失敗病史的患者中，胃活檢標本的SEM分析顯示Hp在所有患者的胃黏膜上形成生物膜，并且當Hp被根除時，所有患者的生物膜都消失了。目前，尚不清楚體內生物膜基質是由細菌自己產生的，還是宿主衍生的基質（例如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白）抑或兩者兼而有之。需要進一步的研究來確定宿主細胞對生物膜細胞外基質的作用。Hp除了可在胃黏膜上皮細胞表面定植，還可以在胃腸道的腺體中定植［6］。這些腺體為Hp提供了一個良好的生長保護性環境。在Hp感染2～4周后，約有50%的腺體受到侵犯，達到平均25～40個細菌/腺體的腺體密度，在慢性感染中也有約10%的腺體受到侵犯。然而，在胃腺體中發現的Hp聚集體與生物膜中的生長方式相似，這可能是導致慢性感染的一個原因。因此，深入研究Hp生物膜生長方式在定植和持久性感染中的潛在作用是有必要的。

2 幽門螺桿菌生物膜形成相關的分子機制

觀察到Hp具有形成生物膜的能力至今已有20年了，近年來越來越多的研究開始聚焦于其生物膜形成的分子機制，多種方法學如蛋白質組學、基因組學、轉錄組學被應用于探索這種分子機制。

Shao C等［7］通過模擬營養缺乏的生存壓力環境，誘導Hp生物膜的產生，通過高分辨率二維凝膠電泳獲得浮游態Hp和早期生物膜中Hp的蛋白質組譜，隨后應用串聯基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionzation time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-TOF MS）鑒定兩者的差異蛋白質斑點，最終鑒定出了35種與Hp早期生物膜形成關系密切的蛋白質。這些蛋白質與多種生物學功能相關，包括鞭毛運動、細菌毒力、信號轉導和調節。Feng-Ling Yang等［8］比較了第4天和第7天Hp生物膜的蛋白質譜與第4天和第7天的浮游態培養物的蛋白質譜，發現中性粒細胞活化蛋白A（NapA）與其他9種壓力誘導的蛋白（包括60-kDa伴侶蛋白、過氧化氫酶、檸檬酸合成酶等）在生物膜中表達顯著增加，同時他們構建了NapA缺失突變的菌株，觀察發現相比于同基因的野生型菌株，突變株的生物膜產生量減少且細菌聚集也明顯減少。

在基因層面，目前研究發現與Hp生物膜形成可能相關的基因較多且復雜，Wong EH等［9］使用結晶紫法測定了32株（1株標準菌株和31株臨床菌株）Hp的生物膜產量，按照生物膜的量分為少量、中等和大量三個組，之后通過對32株菌株進行全基因組測序并將基因序列進行比較后發現三種假設基因K74_10375、K747_09130、K747_06625以及fucT、jhp_1117、homD 和cagA基因與生物膜形成的相關性最大。前三種基因的產物尚不明確，后四種基因編碼的產物分別為α-（1，3）-巖藻糖基轉移酶、鞭毛蛋白、外膜蛋白和細胞毒素相關基因致病島（cagPAI）蛋白。從功能上來看，這些基因所編碼的產物在功能上與Shao C等研究發現的與Hp生物膜形成相關蛋白的功能類似。CagA基因的高表達似乎不難理解，因為普遍認為CagA 陽性的菌株致病力較強，這種較強的毒力可能與生物膜的形成存在聯系。而鞭毛在生物膜形成中的作用同樣值得重視，Wong等［9］在對Hp體外生物膜的研究中發現生物膜的形成依賴于鞭毛的作用，這與鞭毛能夠促進細菌聚集及參與外膜囊泡形成相關。另一項研究通過轉錄組學序列分析發現，在Hp生物膜上調基因中包含了與鞭毛裝置形成有關的基因，進一步證實了鞭毛結構在Hp生物膜形成中的關鍵作用。此外，這項研究還發現生物膜下調的基因主要是參與代謝和翻譯的基因，而與生物膜產量上調相關基因的產物主要在細胞膜上，主要是一些參與應激反應的基因。表明生物膜中細菌的代謝活性較低，且生物膜的形成是一種應激反應［11］。

3 幽門螺桿菌生物膜與抗生素耐藥的相關性

目前，對于Hp感染的一線治療，克拉霉素（clarithromycin，CAM）耐藥性是一個日益嚴重的問題，CAM抗性臨床菌株的分離率約為10%～30%。據報道，Hp 23S rRNA基因結構域V環中的點突變是產生克拉霉素耐藥性的基礎［12］。然而近年來，研究發現Hp生物膜與抗生素耐藥性可能也存在相關性，相比于浮游態的細胞，生物膜細胞對抗生素的抵抗力可增加100～1000倍［13］。目前，已經提出了多種生物膜增加抗生素耐藥性的可能機制：（1）由于細胞外基質的物理屏障作用抗生素未能滲透生物膜；（2）由于生物膜內營養限制而導致生物膜細胞生長緩慢；（3）生物膜內細菌在多種壓力條件下增加了突變的頻率以及抗生素耐藥菌株的產生；（4）生物膜內細菌通過基因水平轉移，整合接合元件和自然轉化增加了抗生素抗性的傳播［14］。盡管Hp生物膜形成對抗生素耐藥性的影響尚未得到充分證實，已有研究發現Hp生物膜的形成與克拉霉素耐藥存在相關性。Yonezawa H等［15］在研究中發現，在CAM的最小抑菌濃度（MIC）水平上，Hp成熟（3d）生物膜相比于中間體（2d）生物膜明顯增加（由0.03增加至0.5μg/ml）；在最小殺菌濃度水平上，生物膜細菌（1.0μg/ml）比浮游態細菌（0.25μg/ml）明顯增加。而且其發現在經過最低抑菌濃度的CAM處理后，Hp培養物生物膜的產量相比于非處理組增加了4倍（2d生物膜）和16倍（3d生物膜）。另一項研究發現，Hp1174（葡萄糖/半乳糖轉運蛋白），這種主要促進子超家族（major facilitator superfamily，MFS）的外排泵在生物膜形成和多重耐藥Hp菌株中高度表達，提示外排泵在Hp生物膜抗生素耐藥性增加中起到一定的作用［16］。

4 幽門螺桿菌生物膜與免疫逃逸的相關性

Hp在感染時可引起宿主上皮細胞的促炎反應，導致免疫細胞的募集，表現為胃炎，盡管有強烈的免疫反應，但其仍可在體內持續存在并最終導致慢性胃炎。然而目前關于Hp如何在免疫系統的攻擊下存活依然了解較少，生物膜的形成被認為可能是一種躲避宿主免疫攻擊的有效機制。生物膜保護細菌免受宿主的適應性免疫反應以及吞噬細胞的吞噬。生物膜還可以為細菌的水平基因轉移（HGT）提供一個理想的環境，這有助于產生一系列具有不同抗原與毒力特征的相關細菌，最終將為細菌提供混淆和壓倒宿主免疫系統的手段［17］。有研究發現感染者對Hp的記憶性CD4+T細胞應答受損，這與Hp特異性調節T細胞并主動抑制其應答相關［18］，而這種抑制可能與Hp生物膜細胞外基質中的蛋白多糖介導的免疫調節有關。另外，有研究表明應用鈣衛蛋白（calprotectin，CP）處理Hp培養物可改變細菌外膜脂質A結構，進而降低細菌表面的疏水性并增加生物膜的形成。CP是一種重要的抗菌因子，是營養免疫營養扣留過程的關鍵組分［19］。為了防止病原微生物感染，人類和其他哺乳動物通過營養免疫限制其獲取必需金屬［20］。很明顯，宿主的營養限制和細菌的營養獲取是傳染病發病機制中的關鍵過程。CP以高親和力結合Mn和Zn，限制這些必需金屬的傳遞，從而形成Mn和Zn限制的隔離環境。而Hp擁有通過改變外膜結構促進生物膜形成來規避CP抗菌活性的能力［21］。

5 總結

綜上所述，Hp生物膜的形成在感染過程中具有不可忽視的作用。相比于浮游態的細菌，對Hp生物膜的研究似乎更貼近于其對人體致病過程的真實情況。在今后的研究中，應鼓勵研究者創建接近體內環境的生物膜體外模型。事實上，生物膜不僅可以存在于胃部，還可以存在于環境中，已有研究證實水源是Hp感染的一個重要來源，研究者通過多種分子學手段在河水中檢測到了Hp的DNA，盡管目前并無證據表明Hp可以在水源中形成生物膜，但其可能嵌入其他細菌形成的生物膜中，并在其中存活［22］。另有研究表明Hp可通過在蔬菜上形成生物膜來延長其存活期［23］。因此，生物膜的形成可能是Hp在胃外環境中重要的傳播方式。另一方面，隨著CAM耐藥率的提高，根除失敗率也日益增高，然而，目前，普遍依然使用浮游細胞評估Hp菌株對體外抗生素的敏感性，但體外MIC并非人胃中抗生素效應的可靠預測因子，所以，作者認為對Hp生物膜形成能力的評估可以在預防和控制抗生素耐藥上發揮重要作用。此外，需要更多的研究進一步探索Hp生物膜的致病機制，針對其形成和在致病過程中的關鍵環節開發新的預防治療策略，為提高根除效率提供新的方案。