滑胎安胎協定方調節PI3K信號通路對腎虛型復發性自然流產子宮內膜蛻膜化的影響*

張旻軼 樓毅云 傅 萍#

1 浙江中醫藥大學研究生院 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德醫院 浙江 杭州 310012

3 杭州市中醫院 浙江 杭州 310007

復發性自然流產大多為早期妊娠丟失，是孕期常見現象，中醫學將本病歸之于“墮胎”“滑胎”等范疇。本研究在前期臨床及實驗研究的基礎上，從腎虛型復發性自然流產入手，觀察磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號通路的相關分子血清和糖皮質激素激酶1（SGK1）、SGK2、SGK3以及子宮內膜蛻膜化標志分子泌乳素（PRL）在腎虛型復發性自然者蛻膜組織中的mRNA的表達，以及應用滑胎安胎協定方后蛻膜細胞中SGK1和PRL的相對表達，以探討滑胎安胎協定方對妊娠早期子宮內膜蛻膜化的進程的影響。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：經杭州市中醫院倫理委員會批準，符合中西醫診斷標準和納入標準[1-2]，選取2013年1月～2018年12月期間在杭州市中醫院就診的妊娠早期（妊娠12周之前）者為研究對象，其中正常早期妊娠要求人工流產者26例作為正常對照組，年齡21～43歲，平均28.69±1.39歲；人工流產次數0～2次，平均0.20±0.09次；孕周6～10周，平均8.04±0.23周。腎虛型復發性自然流產26例為實驗組，年齡19～37歲，平均27.96±0.89歲；自然流產次數2～3次，平均2.00±0.11次；孕周7～11周，平均8.50±0.26周。兩組資料比較，無統計學差異（P＞0.05）。

1.2 蛻膜收集及處理：收集流產者子宮蛻膜組織，50ml離心管，預先分裝生理鹽水，按上述納入和排除標準分組收集對照組和實驗組蛻膜組織，將清宮術中取出的蛻膜組織放入生理鹽水中，置于冰盒內，術后1小時內帶回實驗室。生理鹽水充分洗滌蛻膜組織，盡量除去血塊及血細胞，吸水紙吸凈蛻膜組織表面生理鹽水，剪碎后凍存管分裝，液氮中凍存1小時，在-80℃冰箱凍存。

1.3 藥物制備：受試藥物制備按本研究組前期臨床研究方案制備[3]。精密稱取菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根各200g，阿膠、當歸、杭白芍各150g（滑胎安胎協定方），碾碎制成粗粉，混合后回流提取，旋轉蒸發濃縮，之后濾過，濾液減壓回收定容，至250ml，滅菌分裝備用；取1ml滑胎安胎協定方混合提取物（2g/ml），加入培養液后配制母液（30mg/ml），EP管分裝，放于-20℃冰箱凍存備用。

1.4 蛻膜細胞培養：無菌條件下取得正常妊娠早期人流術后蛻膜組織，放入1%雙抗的培養基，用消毒的眼科剪將蛻膜組織剪碎，消化過濾，1000rpm離心，裂解后置于5%二氧化碳（CO2）培養箱內過夜。用上述制備的滑胎安胎協定方受試藥物處理蛻膜細胞，設為中藥組，培養過夜，并設同期對照組。

1.5 Real-time PCR法檢測PI3K信號通路相關分子mRNA的表達：Trizol一步法提取蛻膜組織和培養后蛻膜細胞的總RNA，總RNA濃度測定后進行PCR擴增，應用逆轉錄聚合酶鏈反應法測定蛻膜組織中SGK1、SGK2、SGK3、PRL、PKD1、CD44和CD44v6的mRNA表達水平，以及測定蛻膜細胞對照組和中藥處理組中SGK1和PRL的mRNA表達水平。

1.6 統計學分析：采用SPSS16.0軟件分析，計量資料以均數±標準誤(±s)表示，進行t檢驗及方差分析。以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮蛻膜組織中PI3K信號通路相關分子的mRNA表達：對納入本研究的26例正常早期妊娠者（對照組）和同期26例腎虛型復發性自然流產患者（實驗組）的子宮蛻膜組織中SGK1 mRNA水平進行分析，發現實驗組蛻膜組織中的SGK1 mRNA表達較對照組下降（P＜0.01），本研究印證了我們前期的研究結果[3]。見圖1。

圖1 正常對照組與實驗組蛻膜組織中SGK1 mRNA表達

圖2 正常對照組與實驗組蛻膜組織中PI3K信號通路上相關分子的mRNA表達

以GAPDH為內參，對SGK1的另兩個亞型SGK2和SGK3、PRL、PDK1、CD44及CD44v6在正常對照組和實驗組蛻膜組織中的表達進行Real time PCR分析，SGK2和SGK3這兩個SGK的異構酶在實驗組蛻膜組織中的mRNA表達低于同期正常對照組（P＜0.01)；子宮內膜蛻膜化標志分子PRL在實驗組蛻膜組織中的相對表達量亦低于正常對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01)。見圖2。

2.2 滑胎安胎協定方對蛻膜細胞中SGK1、PRL mRNA表達的影響：以滑胎安胎協定方處理蛻膜細胞，本研究應用Real time PCR分析對照組以及中藥組蛻膜細胞中SGK1和PRL的表達。SGK1在滑胎安胎協定方處理組中的相對表達量高于對照組（P＜0.05)。子宮內膜蛻膜化標志分子PRL在中藥組蛻膜細胞中的相對表達量亦顯著高于對照組（P＜0.01)。見圖3。

圖3 滑胎安胎協定方對蛻膜細胞中SGK1、PRL mRNA表達的影響

3 討論

復發性自然流產病因復雜，目前胚胎染色體核型異常是公認病因，但隨著自然流產次數的增加，胚胎染色體異常的機率下降，提示其他主導機制的存在，如解剖學、免疫學、內分泌、微生物學以及血栓性疾病等[4-5]。中醫學對本病的認識由來已久，《諸病源候論》列有“妊娠漏候”“妊娠胎動候”，指出“妊娠而恒腰痛者”，為“喜墮胎”之候，提示腎與胞胎的關系。胎者泰然蓬生，若腎氣乏，則沖任不固，胞胎難系[6]。因此，本研究選取腎虛型復發性自然流產作為研究對象。

本研究所用滑胎安胎協定方（菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根、阿膠、當歸、杭白芍）系名老中醫臨證經驗方，方中菟絲子滋補肝腎、固精安胎，是為君藥；覆盆子添精補髓、疏利腎氣，是為臣藥；桑寄生益肝腎祛風濕，苧麻根清熱涼血止血，阿膠養血補血滋陰，杭白芍養血和營柔肝。全方溫而不燥，補而不滯，共同起到益腎安胎的作用。根據藥物組成的性味功效分析，滑胎安胎協定方對腎虛型復發性自然流產有治療效應。

本研究結果表明腎虛型復發性自然流產者子宮蛻膜中PI3K信號通路上相關分子SGK1、SGK2、SGK3、PRL的mRNA表達顯著降低，腎虛型復發性自然流產與子宮蛻膜中PI3K-SGK1通路的下調相關。滑胎安胎協定方提高蛻膜細胞中SGK1、PRL的表達，可通過調節PI3K信號通路，影響子宮內膜蛻膜化的正常進行，維持妊娠的正常進程，改善妊娠結局。本研究在前期研究的基礎上，進一步闡述妊娠早期PI3K及其信號通路上相關分子的表達影響妊娠進程的機理，為中醫補腎治療提供分子理論基礎，為中醫藥防治復發性流產研究提供新的思路。