觀察環境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體對燒傷感染小鼠的治療作用

張歡歡

（河南醫學高等專科學校檢驗系，河南 鄭州 451191）

在醫院感染病原菌中，銅綠假單胞菌占有重要地位，在呼吸科革蘭陰性菌中位居首位。近年來，銅綠假單胞菌耐藥性在大量應用各種廣譜抗菌藥的作用下日益提升。在我國，在所有醫院感染革蘭陰性桿菌中，銅綠假單胞菌位居首位，對碳青霉烯類抗生素的耐藥性已經在30%以上，具有極為復雜的耐藥機制。相關醫學統計數據顯示[1]，合并銅綠假單胞菌感染的死亡燒傷患者占總數的50%。因此，臨床很有必要深入研究噬菌體療法這一抗感染治療方法。本研究觀察了燒傷感染小鼠環境中分離的銅綠假單胞菌噬菌體的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

購買上海新興化工試劑研究所生產的瓊脂粉，杭州天和廠生產的營養瓊脂培養基，Amersco公司生產的CsCl，自行配置LB培養液；河南省人民醫院檢驗科分離并鑒定的21株銅綠假單胞菌；從龍湖鎮居民生活用水下水道中分離噬菌體，經噬菌斑、電鏡觀察鑒定。擴增培養噬菌體后離心，途徑為經CsCl密度梯度，并純化、生理鹽水稀釋，對滴度進行測定，在此過程中將噬菌斑充分利用起來，稀釋到1×1010PFU/ml待用，稀釋過程中將生理鹽水充分利用起來；購買鄭州大學實驗動物中心提供的健康雌性SPF級ICR小鼠，周齡6～8周，平均（7.0±1.0）周；體重18-22g，平均（20.0±2.0）g。

1.2 方法

1.2.1 燒傷感染模型建立

在10 ml LB培養液中按1:100比例稀釋新鮮培養的銅綠假單胞菌，繼續培養到對數生長期，濃度為1×108CFU/ml，A50為0.5左右。分實驗小組為7組，每組5只，將其背部毛剃掉，面積為小鼠體表面積的10%，直徑為2.5 cm的圓形，讓小鼠吸入乙醚對其進行麻醉，待其無足趾反射后在鼠夾上固定小鼠，用90℃的熱水將其燙傷，持續10 s，為了對燙傷引發的體液丟失進行補充，將0.1 ml不同濃度的銅綠假單胞菌皮下注射到燒傷部位，同時給予其皮下注射0.5 ml生理鹽水，將燒傷感染模型建立起來，給予對照組注射等量生理鹽水，對小鼠進行5 d觀察，將最小致死劑量（LD100）設定為1組小鼠全部死亡的最小劑量，并將其設定為燒傷動物模型的感染劑量。

1.2.2 噬菌體療效觀察

分實驗小鼠為6組，每組5只，開始計時時間為建立燒傷感染模型后，感染后即刻、3 h、6 h、12 h、24 h分別給予其腹腔注射0.1 ml效價為1×1010PFU/ml的噬菌體。每組均將對照組設置出來，給予其注射等劑量生理鹽水，將小鼠生存率記錄下來。

1.2.3 滅活噬菌體的治療作用分析

加熱噬菌體30 min，條件為在90℃的溫度下，效價為1×1010PFU/ml，滅活。分實驗小鼠為3組，每組5只，分別給予其注射0.1 ml噬菌體、滅活噬菌體、給予其注射等量生理鹽水（對照組），時間為燒傷感染后即刻。

1.2.4 非宿主菌感染小鼠噬菌體的治療作用分析

分實驗小鼠為3組，分別給予其注射0.1 ml生理鹽水+0.1 ml該噬菌體宿主菌（對照組）、0.1 ml噬菌體+0.1 ml噬菌體宿主菌、0.1 ml噬菌體+0.1 ml噬菌體宿主譜以外的銅綠假單胞菌，時間為燒傷后，將小鼠生存率記錄下來。

1.2.5 噬菌體體內代謝研究

給予實驗小鼠腹腔注射1 ml高濃度噬菌體，時間為開始計時前，分別在第1 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h將血液從小鼠斷尾取出，對噬菌體效價進行測定，在此過程中運用噬菌斑法，重復實驗3次，將濃度時間曲線繪制出來。

1.3 統計學分析

計數資料用率表示，用x2檢驗。采用SPSS 21.0，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 噬菌體分離鑒定

將宿主菌設定為銅綠假單胞菌，將3株銅綠假單胞菌噬菌體從下水道中分離出來，其中寬噬噬菌體1株，電鏡觀察為短尾噬菌體，直徑、尾長分別為45 nm、50 nm，裂解譜、噬菌斑大小分別為6株銅綠假單胞菌、2 mm，命名其為Pap-co1，將1株從6株宿主菌、宿主譜以外的銅綠假單胞菌選取出來，分別命名為Pap-co1、Pap-co2，，在實驗研究中應用。

2.2 細菌最小致死劑量確定

對燒傷小鼠進行感染，途徑為稀釋新鮮培養的細菌Papco1為1×103-1×108PFU/ml，然后將第2 d、5 d小鼠的生存率選取出來，其中第5 d 1×106-1×108CFU/ml劑量組小鼠均死亡，因此絕對最小致死劑量為1×106CFU/ml。

2.3 滅活噬菌體Pap-co1療效分析

滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率80.0%、20.0%，80.0%、0均顯著低于正常噬菌體組100.0%、100.0%（P＜0.05），但滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 Pap-co2燒傷感染小鼠噬菌體的治療作用分析

Pap-co2組、對照組小鼠第2 d、5 d生存率60.0%、0,80.0%、0均顯著低于Pap-co1組100.0%、100.0%（P＜0.05），但Pap-co2組、對照組小鼠第2 d、5 d生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。

2.5 噬菌體Pap-co1體內代謝動力學觀察

給予小鼠腹腔注射噬菌體Pap-co1，其第一時間被吸收，1 h內達到最高峰，24 h內維持噬菌體濃度在104左右，維持在一定濃度范圍內一定時間后逐漸降低。

3 討 論

相關醫學研究表明[2-3]，在燒傷感染小鼠的治療中，寬噬噬菌體具有顯著的作用，同時具有較低的抗原性，能夠將實驗依據提供給抗感染治療中進一步將生物制劑設定為噬菌體。本研究結果表明，對燒傷小鼠進行感染，途徑為稀釋新鮮培養的細菌Pap-co1為1×103-1×108PFU/ml，然后將第2d、5d小鼠的生存率選取出來，其中第5 d 1×106-1×108CFU/ml劑量組小鼠均死亡，因此絕對最小致死劑量為1×106CFU/ml。滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率80.0%、20.0%，80.0%、0均顯著低于正常噬菌體組100.0%、100.0%（P＜0.05），但滅活噬菌體組、對照組小鼠第2 d、5 d的生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。Pap-co2組、對照組小鼠第2d、5d生存率60.0%、0,80.0%、0均顯著低于Pap-co1組100.0%、100.0%（P＜0.05），但Pap-co2組、對照組小鼠第2 d、5 d生存率之間的差異均不顯著（P＞0.05）。給予小鼠腹腔注射噬菌體Pap-co1后第一時間被吸收，1 h內達到最高峰，24 h內維持噬菌體濃度在104左右，維持在一定濃度范圍內一定時間后逐漸降低，和上述研究結果一致，說明噬菌體可以作為一種生物制劑，在抗感染治療中優勢獨特顯著。但是，其對宿主菌具有特異性，因此在臨床的應用受到了限制。基于此，在抗感染治療中，在對噬菌體生物制劑進行應用時，為了顯著提升噬菌體的抗感染治療價值，應該將一個噬菌體庫建立起來，其基礎為細菌的噬菌體分型，并將有效依據提供給臨床進一步深入研究抗感染治療[4]。

綜上所述，燒傷感染小鼠環境中分離的銅綠假單胞菌寬噬噬菌體的治療作用明顯，同時具有較低的抗原性。