孵化期LED綠光照射對壩上長尾雞胚胎期肌纖維發育的影響

郝文文，張 貝，任一帆，孟 婕，鞏 靜，楊 晴，耿立英，張傳生，李祥龍

(河北科技師范學院河北省特色動物種質資源挖掘與創新重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

禽類是光敏性動物，具有特殊的光受體通路[1]。孵化期間對禽類種蛋進行光照調控可促進胚胎的生長發育、提高免疫力及促進孵化后生長期的生長速率及抗壓抗應激能力[2]。因此，科學合理地利用光色信息對于改善禽蛋孵化性能、提高家禽生產性能具有重要意義。

研究表明，光譜對禽類胚胎發育的影響存在區別，其中單色綠光對禽類胚胎發育和肌肉生長的促進作用顯著優于其他光色[3]。肉雞胚胎期給予單色綠光照射能增強代謝，促進雞胚骨骼肌衛星細胞的增殖與分化，顯著增加胚胎后期至出雛后的體質量和胸肌比例，提高出雛率和健雛率[4，5]。進一步的機制研究表明，單色綠光能促進雞胚褪黑激素分泌、肝臟的發育和IGF-1分泌[4,6]，顯著提高胚胎后期及生長期肉仔雞血清GH和IGF-1含量[3,7]，通過MyoD調控途徑促進胚胎骨骼肌衛星細胞的增殖分化，進而實現胚胎肌肉顯著發育[3]。然而，因受遺傳、發育等因素影響，禽類蛋殼的物理化學特性不同，胚胎能接收到綠光的照度也不同。因此，對于不同品種種蛋的最優光照條件均有待研究。本次試驗以壩上長尾雞為研究對象，探索不同照度的單色綠光照射對胚胎期肌肉發育的影響，為壩上長尾種蛋孵化科學合理利用人工光照提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及孵化條件

本次研究中使用的壩上長尾雞種蛋引自張家口市綠色田園禽業科技有限公司，160枚種蛋質量為(52.25±3)g，種蛋進行消毒、編號、稱質量(入孵蛋質量)，孵化器(NLF-320型微電腦全自動孵化器，山東農科孵化設備有限公司，山東德州)規格為長110 cm×寬100 cm×高90 cm。每個孵化器至少提前3個工作日進行運行，孵化箱用溫度計和濕度計進行實時校準和監測。孵化條件：1～6 d孵化溫度為38.0 ℃，濕度為60%；7～18 d孵化溫度為37.8 ℃，濕度為55%；孵化后期溫度為37.2 ℃，濕度為65%。

1.2 實驗方案

設置3個不同照度LED綠光對壩上長尾雞種蛋進行照射，在種蛋孵化的10～18 d給予連續光照(12 h光照-12 h黑暗)。光照度分別為弱光組30～80 lx，中光組90～140 lx，強光組150～200 lx；對照組保持黑暗。在12，14，16，18，20胚齡時每組收集3個種蛋，剝殼后取雞胚的胸肌和腿肌(腓腸肌)用1.44 mol/L的甲醛溶液進行固定24 h，制作石蠟切片。

1.3 主要試劑及儀器

試劑分別為：1.44 mol/L的甲醛溶液(購自石家莊豐悅科技有限公司)，二甲苯(購自泰安正大化工有限公司)，石蠟(購自克拉瑪爾)，蘇木素染液(購自石家莊豐悅科技有限公司)，伊紅染液(購自碧云天生物技術研究所)，鹽酸、中性膠(購自石家莊豐悅科技有限公司)，各級乙醇(國產分析純)。

儀器主要有：微電腦全自動孵化控制器(NLF-320型，山東農科孵化設備有限公司)、系統生物顯微鏡(OLYMPUS-BX40，奧林巴斯(中國)公司)。

1.4 石蠟切片的制作

取雞胚的胸肌和腿肌，剪取小量肌肉塊后快速用1.44 mol/L的甲醛溶液進行固定，24 h之后取出組織塊，裝入包埋盒；乙醇處理，室溫脫水，室溫下浸入二甲苯，脫色。在60 ℃石蠟下浸漬4 h后，進行包埋，冷卻，對其完全脫水。每個組織塊做3張連續組織切片。

1.5 切片HE染色

60 ℃烘片1 h，二甲苯脫蠟；蘇木素染色2 min，水洗，分化液(鹽酸酒精)分化，返藍液(氨水)進行返藍；伊紅染色1 min，水洗；依次過不同濃度乙醇，至二甲苯(1)，二甲苯(2)(各5 min)；膠封片，常溫保存。

1.6 測定與統計

將染色后的切片用顯微鏡進行拍照，用Olympus顯微系統進行觀察，每個時期選取3個胸肌或腿肌樣品的切片，每張切片選取3個不同的視野，每個視野選取至少20條肌纖維，分別測量每條肌纖維平均直徑(μm)和橫截面的面積(μm2)。

數據統計結果分析采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多重顯著性差異，結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 孵化期不同照度綠光照射雞胚胎期腿肌發育的形態學比較

雞胚12～18胚齡是成肌細胞增殖分化成肌管的重要時期。對不同照度LED綠光照射孵化下的壩上長尾雞腿肌進行切片和染色，結果表明，弱光組的壩上長尾雞的腿肌，在12胚齡肌纖維的輪廓比較完整，但還不是特別的清晰，此時肌肉發展處于成肌細胞增殖和分化的混合時期(圖1)。14胚齡時腿肌肌纖維較小；當胚胎16胚齡時，肌纖維直徑逐漸變大，輪廓清晰，肌束內游離的肌纖維逐漸變少，肌細胞融合時間逐漸減少，肌纖維數量基本固定；18胚齡時肌纖維已經基本成熟，未見有明顯的未融合細胞，此時肌纖維數量也已基本確定；20胚齡時肌纖維粗細略有增加。

中光組的壩上長尾雞腿肌，12胚齡時肌纖維輪廓不清晰，肌細胞融合不完全。14胚齡時開始呈現出較清晰的肌纖維輪廓，但仍有許多未融合的肌細胞游離于肌纖維外；到16胚齡時，未融合的細胞大量減少，肌細胞數量逐漸固定；18胚齡時，肌纖維基本成熟，肌纖維數量相對固定；20胚齡時肌纖維直徑增加。

強光組的壩上長尾雞腿肌，在12胚齡時肌肉發育未完全，仍處于肌細胞增殖和分化的混合期，肌細胞融合程度較低；14胚齡時肌細胞輪廓逐漸清晰；16胚齡時肌纖維輪廓更加清晰，肌肉基本完成增殖和分化階段，未融合的細胞明顯減少，肌纖維直徑不斷增大；到18胚齡時肌纖維基本成熟，未有明顯未融合細胞，此時肌纖維數量基本確定。20胚齡，肌纖維直徑增加緩慢。

黑暗組的壩上長尾雞腿肌，在12胚齡時肌細胞融合不完全；14胚齡時肌纖維的輪廓開始呈現，但仍有少量肌細胞未融合。16胚齡時，未融合的肌細胞大量減少，肌纖維數量增加。到18胚齡時，肌纖維發育基本成熟。20胚齡時，肌纖維數目逐漸固定。

孵化期使用不同照度LED綠光照射，結果發現：16胚齡時，壩上長尾雞腿肌肌纖維直徑，強光組顯著低于弱光組、中光組和黑暗組(P<0.05)(表1)。18胚齡時，弱光光照組和中光組壩上長尾雞腿肌肌纖維直徑顯著大于強光組和黑暗組(P<0.05)。在20胚齡時，中光組壩上長尾雞腿肌肌纖維直徑最大，顯著大于弱光組、強光組(P<0.05)；而弱光組腿部肌纖維直徑略大于強光組，但差異不顯著(P>0.05)；黑暗組的腿肌肌纖維直徑最小，顯著低于光照組(P<0.05)。

圖1 不同照度LED綠光孵化下壩上長尾雞胚胎腿肌橫截面

表1 孵化期不同照度LED綠光對壩上長尾雞腿肌肌纖維直徑和橫截面積的影響

2.2 孵化期不同照度綠光照射雞胚胎期胸肌發育的形態學比較

不同照度LED綠光照射壩上長尾雞胚胎胸肌肌纖維發育情況見圖2。由于腿肌和胸肌在發育過程中所受到的調控通路不同，細胞分層和遷徙的具體時期也不一致，因此后期的肌纖維形成也肯定存在差異。通過對壩上長尾雞各胚齡胸肌進行觀察，發現弱光組的壩上長尾雞的胸肌，在12胚齡時肌纖維的輪廓比較模糊。14胚齡時腿肌肌纖維較小；隨著胚齡的增長，16胚齡時肌纖維直徑逐漸變大，游離的肌纖維逐漸變少，肌細胞融合時間逐漸減少，肌纖維數量基本固定；18胚齡時肌纖維已經基本成熟，未見有明顯的未融合細胞，此時肌纖維數量也已基本確定；20胚齡時肌纖維粗細略有增加。

圖2 不同照度LED綠光孵化下壩上長尾雞胚胎胸肌橫截面

中光組的壩上長尾雞胸肌，在12胚齡肌纖維輪廓尚不清晰；14胚齡時開始呈現出較清晰的肌纖維輪廓，但仍有許多未融合的肌細胞游離于肌纖維外；到16胚齡時肌纖維輪廓比較清晰，未融合的細胞大量減少，肌細胞數量逐漸固定；18胚齡時肌纖維數量基本固定；20胚齡胚齡時肌纖維直徑增加。

強光組的壩上長尾雞腿肌，在12胚齡時肌肉發育未完全，仍處于肌細胞增殖和分化的混合期，肌細胞融合程度較低；14胚齡時肌細胞輪廓逐漸清晰；16胚齡時肌纖維輪廓更加清晰，肌肉基本已完成增殖和分化階段，未融合的細胞明顯減少，肌纖維直徑不斷增大；到18胚齡時肌纖維基本成熟，未見有明顯未融合細胞，此時肌纖維數量基本確定。

黑暗組的壩上長尾雞腿肌，在12胚齡時肌細胞融合不完全；14胚齡時肌纖維的輪廓開始呈現，但仍有少量肌細胞未融合；16胚齡時，未融合的肌細胞大量減少，肌纖維數量增加；到18胚齡時肌纖維基本成熟；20胚齡時肌纖維數目逐漸固定。

比較不同照度LED綠光照射壩上長尾雞胸肌肌纖維直徑和橫截面積，結果發現：18胚齡時，黑暗組壩上長尾雞胸肌肌纖維直徑最大，顯著大于光照組(P<0.05)(表2)；在20胚齡時，中光組壩上長尾雞胸肌肌纖維直徑最大，顯著大于弱光組(P<0.05)，黑暗組壩上長尾雞胸肌肌纖維顯著小于中光組和弱光組(P<0.05)。

表2 孵化期不同照度LED綠光對壩上長尾雞胸肌肌纖維直徑和橫截面積的影響

壩上長尾雞胸肌肌纖維橫截面積在18胚齡時中光組最大，顯著大于黑暗組(P<0.05)；弱光組胸肌橫截面積略大于黑暗組，但差異不顯著(P>0.05)；強光組胸肌橫截面積顯著小于黑暗組(P<0.05)。20胚齡時，中光組、弱光組壩上長尾雞胸肌肌纖維橫截面積顯著大于黑暗組(P<0.05)，而強光組的胸肌橫截面積顯著低于黑暗組(P<0.05)。

3 討 論

產肉性能是家禽生產主要的經濟性狀，肌纖維在胚胎期發育的速度與其出生后肌肉生長呈正相關。禽類的胚胎期是成肌細胞增生和肌纖維形成的關鍵時期[8]，在胚胎期肌纖維數量基本固定，出生后肌纖維數量基本不變，出雛后肌肉系統發育主要有兩方面：一是肌纖維長度逐漸增長，二是肌纖維橫截面積變大[9]。本次研究利用不同照度LED綠光燈對壩上長尾雞胚胎期進行照射，表明適宜LED綠光照度對壩上長尾雞胚胎期的肌纖維發育有促進作用，與以前的調查結果一致[10]。雞胚的腿肌和胸肌是由體節發育而來的軸下肌節是形成軀干和四肢肌肉的來源[11]，雖然都是來源于單一的體節，腿肌和胸肌的發育卻依賴于不同的生肌程序和發育通路。這些發育通路具有不同特點，導致腿肌和胸肌在胚胎期發育不一致[12]，雞的胸肌肌原細胞在4胚齡才開始發育，而腿肌肌原細胞在2.5胚齡就已開始發育[13]。

禽類的眼睛和下丘腦是光的感受器，在孵化期光感受器收到光信號刺激，分泌褪黑激素增加，從而使生長激素釋放激素分泌增加，生長素含量增加，導致肝臟分泌IGF-1(胰島素樣生長因子)增加，促進生長軸基因表達，骨骼肌衛星細胞分裂增加，促進肌纖維發育。有研究報道：在雞的生長前期，綠光是通過刺激衛星細胞的增殖，進而促進肌原細胞的數量增加。本次研究中，20胚齡時綠光照射孵化下雞胚腿肌肌纖維面積和腿肌肌纖維直徑均顯著大于黑暗組，而中光組(90～140 lx)最顯著，這與張林等[14]在肉仔雞孵化給予單色光間歇性刺激的研究結果一致。研究還發現，禽類腿部肌肉發育快于胸部肌肉，腿肌纖維發育不僅在融合形成上比胸肌快，而且在后期肌纖維肥大過程中也快于胸肌纖維。由研究結果推測，雞胚發育末期，不同照度LED綠光照射對壩上長尾雞肌肉發育存在差異，而這種差異可能是LED綠光燈照影響到肌肉發育的調控通路上。

4 結 論

壩上長尾雞種蛋在孵化期間給予適當的LED綠光照射，可以促進雞胚胎期肌纖維發育。其中，使用90～140 lx的LED綠光照射時壩上長尾雞腿肌肌纖維和胸肌肌纖維發育效果最佳，而孵化期使用150～200 lx的LED綠光照射時，對壩上長尾雞胚胎期胸肌肌纖維的發育有一定程度的抑制作用。