熱應激致大鼠睪丸中熱休克蛋白A2及幾種熱休克轉錄因子的表達變化研究*

李 銳 陳雪丹 張慶華**

1. 陸軍軍醫大學大坪醫院生殖醫學中心（重慶400042）；2. 陸軍軍醫大學基礎醫學院醫學遺傳學教研室（重慶400038）

前 言

男性不育已成為一個全球性的人口健康問題，而精子質量下降是造成男性不育的主要原因。 Levine 等[1]研究發現， 僅1973 年至2011 年人類精子數量就下降了52.4%。 睪丸是精子發育的重要場所，影響其正常結構和功能的外界因素眾多，大體上可分為物理因素、化學因素以及生物因素。 其中，物理因素中的高溫對精子的損傷機制為研究熱點之一。

熱休克反應（Heat-Shock Response,HSR）是生物機體在熱應激（或其他應激）狀態下所表現的一種以基因表達變化為特征的防御適應性反應。 對于大多數體細胞，這種反應旨在保護細胞免受損傷[2]，但對于睪丸內的生殖細胞（主要是減數分裂細胞和減數分裂后的細胞），熱應激并未促發這種保護性反應。 與此相反，受影響的生殖細胞通過凋亡途徑被清除了[3]。 現有研究表明，熱應激可導致精子濃度降低，精子活性及運動能力受損[4]。 此外，熱應激下精子頭部的某些性狀也可發生改變，并直接影響受精[5]。 但熱應激導致精子發育功能障礙的內在機制還知之甚少。 既往研究提示[6-8]，熱應激可能通過誘導普列克底物蛋白同源樣結構域家族A 成員1 蛋 白（pleckstrin homology-like domain family A member 1,PHLDA1）、 佛波醇-12- 肉豆蔻酸-13- 乙酸誘 導 蛋 白 1（Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced Protein 1, PMAIP1）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）等的表達上調，最終引發生精細胞凋亡。 這可能在一定程度上說明熱應激致精子數量減少的本質原因， 卻很難解釋由熱應激所導致的精子活性及運動能力損傷。 因此，一個可能的推測是，多種因素聯合作用共同介導了熱應激下精子損傷的發生。 現已知一系列熱休克蛋白（heat shock protein , HSP ） 及 熱休 克 轉錄因子（heat shock factor,HSF）參與了精子發育過程。尤其是熱休克蛋白A2（heat shock protein A2,HSPA2），其為一種在睪丸中組成型高表達的HSP， 大量研究證實其對精子發生及其成熟都是必不可少的， 而HSF 在精子發育中的作用也見諸報道[9-10]。 HSF 又是調節HSP 表達的轉錄因子，研究發現[10]，人基因組共編碼6 種HSF，即HSF1、HSF2、HSF4、HSF5、HSFX 和HSFY，它們在哺乳動物精子發生的過程中均有表達，但其表達譜呈現較大差異，其中HSF5 和HSFY 僅在睪丸中表達，HSF2 為全身性表達，但在睪丸中表達量較高，HSF4 可見于多種組織，但主要在晶狀體中表達，而HSF1 為全身性表達，無明顯組織特異性，是介導熱休克反應的主要轉錄因子。

本研究試圖通過構建大鼠生殖系統的熱應激模型， 對大鼠睪丸中的HSPA2 及幾種HSF 作定量分析，以期進一步揭示熱應激致精子發育功能障礙的可能機制， 同時可為熱應激造成男性不育的基因治療和新藥研發提供一定的理論依據。

材料與方法

一、實驗動物

16 只SPF 級雄性SD 大鼠購自陸軍軍醫大學實驗動物中心，8 周齡，體重約180～210g，均安置在帶有松木屑墊層的聚碳酸酯籠子中，飼養于 以12 小時為周期明/暗交替、 溫度及濕度可控的房間內，SPF 級大鼠維持飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，2010250213）及飲水可自由獲取。 陸軍軍醫大學實驗動物中心為重慶市市場監督管理局計量認證合格單位，由重慶市實驗動物質量檢測中心作公正性申明。 動物飼養及操作嚴格遵守陸軍軍醫大學動物保護與利用專業委員會有關規定。 本研究所用動物及使用已獲陸軍軍醫大學動物福利倫理委員會批準。

二、主要儀器與試劑

HOPE-MED 8150E 型特定環境智能型模擬實驗艙（天津合普公司），CFX Connect 實時定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），PowerPac Basic 基本型電源電泳儀、ChemiDoc Touch 化學發光成像系統（美國Bio-Rad 公司）， 熒光定量PCR 試劑盒2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green I）（擎科新業生物技術有限公司，TSE201），HSPA2 特異性單克隆抗體（華安生物技術有限公司，ET1701-15），HSF1 多克隆抗體（博奧森生物技術有限公司，bs-3757R），HSF2 多克隆抗體（博奧森生物技術有限公司，bs-1409R），HSF5 多克隆抗體（美國賽默飛世爾科技公司，PA5-69484），HSFY 多克隆抗體（美國賽默飛世爾科技公司，PA5-28352），次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase,HPRT） 單克隆抗體（杭州華安生物技術有限公司，JU03-26），HRP 標記山羊抗兔二抗（聯科生物技術股份有限公司，70-GAR007）。

三、實驗方法

（一）實驗分組及模型建立

將16 只大鼠適應性飼養1 周后，隨機等分為熱應激組和對照組。 開啟HOPE-MED 8150E 型特定環境智能型模擬實驗艙（以下簡稱高溫艙），設定溫度為43℃，待艙內溫度上升至設定值并穩定片刻后，將熱應激組8只大鼠連同聚碳酸酯籠子（撤去飼料及飲水） 一起置入，計時30 分鐘后取出。 對照組8 只大鼠除不進行熱應激處理外，其余處理與熱應激組完全相同。

（二）取材

熱應激組大鼠于高溫艙內取出后3 小時（鑒于3小時為熱應激模型的關鍵時相點之一[11-13]），處死所有大鼠，將其仰臥放置于實驗臺上，用外科剪剪開其下腹部皮膚層及肌肉層后， 以鑷子向頭側方向牽引下腹部脂肪組織，待雙側睪丸顯露后，分離出附睪及周圍脂肪組織，將取下的睪丸組織分裝編號，先以液氮速凍，再保存于-80℃。

（三）實時熒光定量PCR 法檢測睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 及HPRT 基因mRNA 的表達

HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 及HPRT（內參）基因引物序列如表1 所示， 所有引物均由擎科新業生物技術有限公司合成。 將取材于熱應激組和對照組大鼠的睪丸組織全部自-80℃取出，各稱取約20 毫克，使用RNAprep Pure Tissue Kit 法提取大鼠睪丸組織總RNA，經Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2 法逆轉錄得到各自的cDNA，最后使用表1 所示引物，根據2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green I）法進行實時熒光定量PCR（反應體系10μl，反應條件：95℃預變性3 分鐘；95℃10 秒，57℃10 秒，72℃30 秒，共40 個循環）。 PCR 反應結束后，對熔解曲線及其變化率曲線進行分析，觀察是否存在非特異性擴增。 根據反應所得Ct 值，以HPRT 為內參，按照2-ΔΔCt 法計算目的基因mRNA 相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列及擴增產物長度

（四）Western blot 法檢測睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 及HPRT 蛋白的表達

于-80℃取出全部16 份大鼠睪丸組織樣本， 各稱取約100 毫克置于EP 管中， 依次加入1ml RIPA 裂解液，10μl PMSF，提取總蛋白。將待測樣品依次加入上樣孔進行電泳，采用半干轉法轉膜7 min，封閉約1.5 h。根據目的蛋白條帶所在位置裁剪PVDF 膜后， 加入到對應的一抗溶液中，4℃孵育過夜。 經TBST 洗滌3 次（20min/ 次）后，加入二抗溶液中，4℃孵育約1.5 h。 經TBST 洗滌3 次（20min/ 次）后，置于ChemiDoc Touch化學發光成像系統中拍照。 以HPRT 為內參，各目的蛋白表達量以相對灰度值表示。 實驗過程中，各目的蛋白和內參蛋白上樣體積、一抗及二抗稀釋比例見表2。

表2 目的蛋白及內參蛋白上樣體積、一抗及二抗稀釋比例

（五）數據分析

使用SPSS 20.0 對數據作統計分析。 本研究對大鼠分組采用的是完全隨機法， 熱應激組與對照組為兩組獨立樣本。 分別對兩組數據作正態性檢驗和方差齊性檢驗，若符合參數檢驗條件則使用T 檢驗，不滿足參數檢驗條件時使用非參數檢驗法。 對于檢驗結果的解讀：若P＞0.05 則判定差異不顯著，結果無統計學意義；若P＜0.05 則判定差異顯著，P＜0.01 則判定差異極顯著，此二者結果均具有統計學意義。 使用GraphPad Prism 8.0對數據進行統計作圖。

結 果

一、熱應激對大鼠睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 基因mRNA 表達量的影響

熱應激組與對照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 基因mRNA 表達的檢測結果如圖1 所示。與對照組相比，熱應激組HSPA2（P＜0.0001，1A）、HSF2（P=0.0006，1C）及HSFY（P=0.0002，1E）的相對表達量極顯著降低，HSF1（P=0.0102，1B）與HSF5（P=0.0237，1D）的相對表達量顯著降低。

二、熱應激對大鼠睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白表達量的影響

熱應激組與對照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白的檢測結果及其相對表達圖如圖2、圖3 所示。熱應激組與對照組HSPA2（P=0.5624，3A）、HSF1（P=0.3292）、HSF2（P=0.9928，3C）、HSF5（P=0.8118，3D）、HSFY（P=0.6864，3E）的表達量無顯著差異。

圖1 熱應激組與對照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 基因mRNA 相對表達量的比較

圖2 熱應激組與對照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白的Western 印跡圖

圖3 熱應激組與對照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白相對表達量的比較

討 論

男性不育問題已在全球范圍內引起了廣泛關注，而造成男性不育的關鍵因素就是精子質量的下降。 精子的發生及其成熟是極其復雜的生物學過程， 因此導致精子發育功能障礙的因素也可能是多方面的， 而高溫正是其中之一。 既往研究從不同角度回答了熱應激導致精子數量減少的內在原因， 但熱應激致精子活性及運動能力損傷的本質原因卻少見報道。 據此推測，熱應激致精子發育損傷可能涉及到更多不同的機制。

現有研究表明，在睪丸中大量表達的HSPA2 表達異常或功能障礙，都會顯著地影響精子發育，這種影響不僅體現在精子發生的過程中， 還體現在精子功能轉化的過程中，最終可能導致精子數量減少、形態異常以及功能障礙[9]。 此外，有研究指出，HSF 也與精子發育過程緊密相關， 被單獨敲除HSF1 或HSF2 的雄性小鼠，其精子數量明顯減少， 頭部形態異常的精子數量明顯增多，有趣的是，這些雄性小鼠的生育能力并未顯著降低， 但被同時敲除HSF1 和HSF2 基因的雄性小鼠，則因精子發生完全受阻而表現為絕對不育[10]。 綜上所述，我們認為HSPA2 及HSF 很可能在熱應激過程中介導了精子損傷的發生。 本研究選擇在睪丸中高量表達的HSPA2，在睪丸中特異性表達的HSF5 和HSFY，主要在睪丸中表達的HSF2 以及介導熱休克反應的關鍵轉錄因子HSF1 作為重點研究指標，試圖通過構建大鼠熱應激模型， 從動物水平上探索熱應激致精子發育功能障礙的可能機制。

本研究通過實時熒光定量PCR 技術檢測了熱應激組與對照組HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5 及HSFY 基因mRNA 的相對表達量，結果發現對照組HSPA2（P＜0.0001，1A）、HSF2（P=0.0006，1C）及HSFY（P=0.0002，1E）的相對表達量極顯著高于熱應激組，HSF1（P=0.0102，1B）與HSF5（P=0.0237，1D）的相對表達量顯著高于熱應激組。 Krawczyk 等研究發現，為大鼠實施隱睪術后2 天，檢測到2.5 kb RNA（即HSPA2）顯著降低，該發現與本研究結果中熱應激致HSPA2 基因mRNA 表達下調相一致， 同時也可能為臨床上常見的隱睪或可回縮睪丸（睪丸常位于陰囊與腹股溝管之間，將捫及的睪丸逐漸推入陰囊內， 松手之后睪丸能在陰囊內停留， 并非隱睪）所致的生育功能障礙提供一定的解釋，但從本質上講，無論是暴露于高溫環境，施行隱睪術，還是先天性隱睪或可回縮睪丸都客觀上破壞了精子發育的最佳條件[14]（通常陰囊內部溫度比核心體溫大約低2～7℃），均可能通過誘導熱應激反應致使HSPA2 表達下調，并進一步影響正常精子發育。 既往研究表明，HSF1 是熱休克反應的主要調節因子。 生理條件下，它以無活性的單體形式存在于與HSP 及其他蛋白質的復合體中。 應激條件下，其可從與之相結合的復合體中解離，這些非結合單體可進一步轉變為具有轉錄活性的三聚體。 在多數哺乳動物細胞和組織(如肝、腎、肺)中，HSF1 在41℃或更高溫度下才會激活， 而在睪丸中，HSF1 在較低溫度(35～38 ℃)下即可被激活。 有趣的是，本研究發現熱應激下睪丸中HSF1 基因mRNA 的表達量實際是下調的。 有研究顯示，HSF1 在熱應激下可能具有兩種完全相反的功能， 其在耐熱細胞中（大多數體細胞皆屬此類）可激活保護性HSP 的表達，此時促凋亡蛋白的表達是受阻的， 而在熱敏感細胞中則可激活促凋亡蛋白的表達，此時保護性HSP 的表達是受阻的。 既往研究表明， 活化的HSF1 并未在減數分裂和減數分裂后的生精細胞中誘導保護性HSP 表達，相反，HSF1 通過激活促凋亡蛋白(PMAIP1,PHLDA1)表達，最終導致生精細胞凋亡[10]。 顯而易見，睪丸中的生精細胞（主要指減數分裂和減數分裂后的生精細胞）屬于熱敏感細胞。盡管熱應激下HSF1 表達下調的內在機制尚不得而知，但如前所述， 當活化的HSF1 在熱敏感的生精細胞中介導凋亡途徑時，保護性HSP 的表達受阻。 因此，我們似乎可以作出一個合理的推測， 即HSF1 的表達下調與保護性HSP 的表達受阻很可能具有某種內在關聯，但尚需進一步研究證實。盡管單獨敲除HSF1 或HSF2 并沒有對雄性小鼠的生育能力造成顯著影響， 但同時敲除HSF1 和HSF2 時直接導致了雄性小鼠的絕對不育。造成這種奇怪現象的一個可能原因是，HSF1 和HSF2之間具有功能互補性。 不難發現，HSF1 和HSF2 與精子發育也具有緊密關聯， 盡管其調節精子發育的具體機制目前尚不明確， 但可以推斷兩者表達水平同時降低極可能會影響正常的精子發育。關于HSF5 和HSFY的功能目前尚少見文獻報道， 但作為睪丸中特異性表達的兩種熱休克轉錄因子， 其對精子發育的作用值得深入探討， 對其作用的揭示也有助于闡明熱應激致精子發育功能障礙的內在機制。綜上所述，我們推測熱應激很可能通過下調HSPA2、HSF1、HSF2 的表達介導精子損傷的發生。 值得注意的是，HSF5 和HSFY 的表達也顯著下調了， 但關于兩者在精子發育中的確切作用還有待進一步研究。

本研究WB 實驗結果顯示， 熱應激組與對照組HSPA2（P=0.5624，3A）、HSF1（P=0.3292）、HSF2（P=0.9928，3C）、HSF5（P=0.8118，3D）和HSFY（P=0.6864，3E）蛋白相對表達量均未見顯著差異， 與實時熒光定量PCR 的結果不一致。 原因可能是多方面的。 第一，既往研究表明HSF 可經歷多種翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、蘇素化、泛素化等，而HSPA2 也可發生翻譯后修飾[15]。 熱應激可能會改變蛋白質的翻譯后修飾狀態， 進而影響其抗原性，并最終對WB 的定量結果造成干擾。 第二，基因表達包含了轉錄和翻譯兩個層面， 而轉錄和翻譯發生的時間和位點是存在時空間隔的， 所以一個可能的原因是， 實驗過程中處死大鼠的時間點HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5 及HSFY 蛋白表達尚未發生顯著差異。 第三，相比于WB 檢測蛋白，實時熒光定量PCR 檢測mRNA 的靈敏度要高很多，因此在本實驗中，熱應激組與對照組蛋白的相對表達值可能已經存在實質性差異，只是WB 未能檢出。 第四，實驗樣本量太少或樣本之間的個體差異性太大，或樣本的代表性不足，也可能是導致WB 實驗結果與實時熒光定量PCR 結果不一致的重要原因。 總之，本研究尚存在諸多不足之處，我們將在后期研究中進一步探索。

綜上所述， 本研究證實熱應激導致大鼠睪丸中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5 及HSFY 基因mRNA 表達量顯著下調，提示熱應激很可能通過下調HSPA2 及系列HSF 的表達，進而介導精子損傷的發生，可為臨床上男性不育的基因治療和新藥研發提供有價值的理論參考。 如前所述，HSF 是調控HSP 表達的轉錄因子，但迄今為止HSPA2 是否接受HSF 的調控尚無定論。 盡管HSF1 和HSF2 對精子發育的影響研究已取得部分進展，但其影響精子發生的具體機制不明。研究表明[16]，表觀遺傳機制可能是調控HSPA2 基因表達的首要因素，但熱應激過程中是否也涉及到類似的機制，值得探討。總之，HSPA2 及HSF 在熱應激過程中表達下調的本質原因尚有待進一步研究。