GITRL對肺癌移植瘤小鼠髓源性抑制細胞免疫抑制功能的調控及其分子機制

張蓓蓓，朱秋鋼，芮棵，王勝軍，田潔

(1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇 鎮江 212001)

髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是一群具有免疫抑制能力、未成熟的異質性髓系細胞[1]。MDSCs可分為兩個亞群，多核細胞樣MDSCs(PMN-MDSCs)和單核細胞樣MDSCs(M-MDSCs)。在小鼠中，MDSCs兩個亞群均高表達CD11b和Gr-1，Gr-1包含Ly-6G和Ly-6C兩個抗原表位，PMN-MDSCs表型為CD11b+Ly-6G+Ly-6Clow，而M-MDSCs的表型則為CD11b+Ly-6G-Ly-6Chigh。研究表明，荷瘤小鼠和腫瘤患者體內存在大量MDSCs的浸潤[2]。MDSCs在腫瘤免疫微環境中大量擴增，并參與腫瘤的病理過程[3]。一方面，腫瘤免疫微環境通過分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、IL-6等細胞因子，促進MDSCs的增殖與功能；另一方面，MDSCs通過合成免疫抑制性效應分子如精氨酸酶-1(Arg-1)、活性氧和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，抑制機體抗腫瘤免疫，從而促進腫瘤發展[4]。MDSCs的免疫抑制功能受多組信號的調控，包括JAK/STAT、PI3K/AKT等信號通路[5]。

糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關配體(glucocorticoid induced TNF receptor ligand,GITRL)是腫瘤壞死因子超家族成員，主要高表達于抗原提呈細胞和內皮細胞的表面，其受體GITR則高表達于活化的T細胞、B細胞和中性粒細胞[6]。在腫瘤中，GITRL可作為共刺激分子，促進效應T細胞的活化，并抑制調節性T細胞的功能，促進機體正向免疫應答，因此，GITRL可有效增強機體抗瘤免疫應答[7-8]。GITRL是否通過調控MDSCs的免疫抑制功能進而增強機體抗瘤免疫應答尚需進一步研究。本研究利用GITRL蛋白刺激Lewis肺癌移植瘤小鼠來源的MDSCs，檢測GITRL處理后的MDSCs對野生型小鼠來源的CD4+T細胞增殖的影響以及胞內相關免疫抑制效應分子的表達，觀察GITRL對腫瘤來源的MDSCs免疫抑制功能的調控作用，并探究其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡SPF 級雄性C57BL/6小鼠，質量(24±2)g，購于江蘇大學動物中心(合格證編號:NO.201905095)。小鼠Lewis肺癌細胞株購于上海生命科學研究院細胞庫。

DMEM，1640培養液，小牛血清，胎牛血清(以色列BI公司)；抗生物素磁珠，小鼠CD4+T細胞分選試劑盒(德國美天旎公司)；生物素標記的抗小鼠CD11b抗體，PE/Cy5標記的大鼠抗小鼠CD11b抗體，PE標記的大鼠抗小鼠Gr-1抗體，FITC標記的大鼠抗小鼠GITR抗體，PE/Cy5標記的大鼠抗小鼠CD4抗體(美國BioLegend公司)；哺乳動物蛋白提取液(北京康為世紀生物科技有限公司)；精氨酸酶檢測試劑盒(美國BioAssay systems公司)；一氧化氮檢測試劑盒(美國Promega公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；兔抗小鼠p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-肌動蛋白抗體，HRP標記的羊抗兔IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 構建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型

培養Lewis肺癌細胞至對數生長期，將細胞從培養瓶中消化下來，并重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，細胞濃度為1×107/mL。于C57BL/6小鼠右側背部皮下注射0.1 mL Lewis肺癌細胞懸液，即每只小鼠注射1×106Lewis肺癌細胞。

1.3 磁珠分選MDSCs

處死Lewis肺癌移植瘤小鼠，取脾臟研磨成細胞懸液，裂解紅細胞后，加入生物素標記的抗小鼠CD11b抗體(10 μL/108細胞)，彈勻后置于冰上孵育30 min；洗去多余抗體，加入抗生物素磁珠(12 μL/108細胞)，置于冰上孵育30 min；洗去多余抗體，將細胞重懸于500 μL PBS-EDTA緩沖液中，將其加入分選柱中，再加入PBS-EDTA，待分選柱中的液體流盡后，向柱中加入5 mL PBS-EDTA，用推柱將液體從柱中用力推出，收集細胞。

1.4 流式細胞術檢測MDSCs的純度及表面GITR的表達

取1×106個MDSCs，重懸于100 μL PBS，加入PE/Cy5標記的大鼠抗小鼠CD11b抗體、PE標記的大鼠抗小鼠Gr-1抗體和FITC標記的大鼠抗小鼠GITR抗體(或同型對照抗體)，于4℃孵育30 min。加入PBS洗滌，4℃、500 ×g離心5 min，用流式細胞儀檢測細胞表面Gr-1、CD11b、GITR的表達。

1.5 磁珠分選CD4+ T細胞

取野生型C57BL/6小鼠脾臟，研磨成細胞懸液，裂解紅細胞后，加入抗小鼠CD4磁珠(10 μL/108細胞)，彈勻后置于冰上孵育30 min；PBS-EDTA洗去多余抗體，將細胞重懸于500 μL PBS-EDTA中，將其加入分選柱中，再加入PBS-EDTA，待分選柱中的液體流盡后，向柱中加入5 mL PBS-EDTA，用推柱將液體從柱中用力推出，收集細胞。

1.6 MDSCs對CD4+ T細胞增殖的抑制試驗

取96孔U形底培養板，向孔中加入50 μL碳酸鹽包被液和0.5 μL抗小鼠CD3單克隆抗體(1 μg/μL)，4℃孵育過夜，洗去游離的抗體。將CD4+T細胞重懸于1 mL PBS中，加入羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)染料，終濃度為5 μmol/mL，于37℃水浴鍋中避光孵育10 min。立即向試管中加入5 mL預冷的1640培養液(含10% 胎牛血清)終止反應。用1640培養液(含10% 胎牛血清)洗滌3次。收集GITRL(5 μg/mL)處理48 h后的MDSCs，將MDSCs和CD4+T細胞按1 ∶1的比例種入96孔培養板中，每孔共5×105個細胞。陽性對照孔中加入5×105個CD4+T細胞。每孔加入0.5 μL抗小鼠CD28單克隆抗體(1 μg/μL)，將培養板置于培養箱中，避光孵育72 h。收集細胞，加入PE/Cy5標記的大鼠抗小鼠CD4抗體，于4℃孵育30 min。加入PBS洗滌，4℃、500×g離心5 min，用流式細胞儀檢測CD4+T細胞的增殖情況。

1.7 比色法檢測MDSCs胞內Arg-1的活性

收集GITRL(5 μg/mL)處理48 h后的MDSCs，加入哺乳動物蛋白提取液提取蛋白。配置底物緩沖液、標準品、顯色液，分別將標準品和待測樣本加入檢測孔中，并設置空白對照孔，每孔加入10 μL底物緩沖液，將檢測板放入水浴鍋中，37℃避光孵育2 h。每孔加入200 μL顯色液，室溫避光孵育10 min。用酶標儀讀取520 nm波長處的光密度值，計算酶活性。

1.8 Griess偶聯法檢測MDSCs一氧化氮釋放量

GITRL(5 μg/mL)處理MDSCs 48 h后，收集培養上清液。將標準品和待測上清液分別加入檢測孔中，每孔50 μL，再加入50 μL對氨基苯磺酰胺緩沖液，室溫避光孵育5 min，加入50 μL顯色液，室溫避光孵育5 min。用酶標儀讀取520 nm波長處的光密度值，計算待測樣本一氧化氮的含量。

1.9 蛋白質印跡法檢測MDSCs胞內信號分子

將MDSCs接種于24孔培養板中，使每孔1×106個細胞，加入5 μg/mL GITRL蛋白，分別于0、30、60 min后收集細胞，加入哺乳動物蛋白提取液提取蛋白。配制10% SDS-PAGE凝膠，加入適量蛋白樣本進行電泳，以350 mA恒流轉膜1.5 h，將轉有蛋白的PVDF膜置于5%牛血清白蛋白中室溫封閉1 h。分別加入兔抗小鼠p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3(1 ∶1 000)和β-肌動蛋白抗體(1 ∶5 000)，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌后，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌后曝光。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 Lewis荷瘤小鼠脾臟MDSCs表達GITR

通過流式細胞術檢測MDSCs的純度，磁珠分選后CD11b+Gr-1+細胞達90%以上，可用于后續實驗研究。流式細胞術檢測結果顯示荷瘤小鼠來源的MDSCs表面表達GITR。見圖1。結果說明Lewis荷瘤小鼠脾臟浸潤的MDSCs表達GITR。

圖1 荷瘤小鼠脾臟MDSCs分選純度及表面GITR的表達

2.2 GITRL抑制荷瘤小鼠脾臟MDSCs的免疫抑制功能

GITRL蛋白(5 μg/mL)刺激MDSCs 48 h后，與CD4+T細胞共培養72 h。流式細胞術結果顯示，與對照組相比，GITRL處理組的MDSCs對CD4+T細胞增殖的抑制能力明顯減弱。此外，GITRL處理組MDSCs的Arg-1活性明顯降低(t=4.208,P<0.05)，一氧化氮釋放量明顯減少(t=5.355,P<0.01)。見圖2。結果說明GITRL可抑制荷瘤小鼠脾臟MDSCs的免疫抑制功能。

圖2 GITRL對荷瘤小鼠脾臟MDSCs免疫抑制功能的影響

2.3 GITRL調控MDSCs胞內信號分子的表達

蛋白質印跡結果顯示，GITRL處理30 min后，MDSCs胞內JAK2(t=4.056,P<0.05)和STAT3(t=5.452,P<0.01)的磷酸化蛋白水平顯著下降。GITRL處理60 min后，與0 min相比，MDSCs胞內JAK2(t=7.376,P<0.01)和STAT3(t=13.340,P<0.01)的磷酸化蛋白水平顯著下降；與30 min相比，MDSCs胞內JAK2(t=3.539,P<0.05)和STAT3(t=4.169,P<0.05)的磷酸化蛋白水平顯著下降。見圖3。結果說明GITRL可下調MDSCs胞內JAK2和STAT3的活性。

圖3 GITRL對MDSCs胞內信號分子的調控

3 討論

研究表明，GITR/GITRL信號系統參與多種疾病的發生與發展過程，包括腫瘤、感染、炎癥和自身免疫病[9]。在腫瘤微環境中，T細胞表面GITR的表達明顯升高，GITR信號的觸發除了能激活效應T細胞，抑制調節性T細胞的功能，還能促進輔助性T細胞的分化[10-11]，促進樹突狀細胞的抗原提呈功能[12]，參與巨噬細胞的活化過程[13]，從而增強機體免疫應答。利用抗GITR單克隆抗體DTA-1可通過激活免疫系統增強機體抗腫瘤免疫反應，有效治療腫瘤[14]。DTA-1通過促進效應T細胞的免疫應答，同時抑制調節性T細胞的免疫抑制功能，發揮治療腫瘤的作用。有研究報道，DTA-1對IFN-γ基因缺陷的荷瘤小鼠無治療作用[15]。此外，當小鼠體內的CD8+T細胞被清除時，DTA-1對荷瘤小鼠的治療作用消失[16]。以上結果表明，DTA-1主要通過觸發CD8+T細胞表面的GITR信號，增強抗腫瘤免疫。

MDSCs通過抑制宿主免疫反應影響腫瘤局部微環境。MDSCs作為腫瘤微環境中重要的免疫抑制性細胞，能有效對抗機體的抗腫瘤免疫反應，并削弱臨床抗腫瘤治療的效果[17]。研究表明，腫瘤局部浸潤的MDSCs數量與疾病嚴重程度呈正相關，且抑制MDSCs的功能或直接清除體內MDSCs可有效抑制腫瘤的疾病進展[18]。因此，MDSCs是抗腫瘤免疫治療的重要靶點。目前，臨床上針對MDSCs的療法主要包括抑制MDSCs的分化、遷移、擴增和免疫抑制功能，如通過吉西他濱、5-氟尿嘧啶耗竭體內的MDSCs，或通過小分子抑制劑和免疫檢查點阻斷劑阻斷MDSCs發育所需的信號，以達到治療腫瘤的目的[19]。本研究表明腫瘤微環境中的MDSCs表達GITR，且利用GITRL處理MDSCs可顯著下調其免疫抑制功能，具體表現為MDSCs對野生型小鼠來源的CD4+T細胞增殖的抑制能力下降，相關免疫抑制效應分子Arg-1和一氧化氮表達降低，提示GITRL可通過激活MDSCs表面的GITR，抑制MDSCs的免疫抑制功能，從而增強抗腫瘤免疫應答。

JAK/STAT是調控MDSCs的免疫抑制功能的關鍵信號通路。研究表明，在肝臟轉移性腫瘤模型中，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子通過激活MDSCs胞內JAK2/STAT3信號通路促進MDSCs的免疫抑制功能，且阻斷JAK2/STAT3信號通路可增強抗腫瘤免疫治療效果。因此，JAK2/STAT3信號通路可調控MDSCs免疫抑制功能[20]。在本研究中，我們發現GITRL通過激活MDSCs表面的GITR，抑制胞內JAK2/STAT3信號通路。

綜上，荷瘤小鼠來源的MDSCs表面表達GITR，GITRL處理可抑制MDSCs胞內與其功能相關的JAK2/STAT3信號通路。因此，GITRL可能通過抑制MDSCs胞內JAK2/STAT3信號通路下調腫瘤微環境中MDSCs的免疫抑制功能。本研究進一步闡釋了GITRL抗瘤免疫機制，為臨床腫瘤的治療提供了新的思路和理論基礎。