縱條紋炭角菌子實體的急性毒性試驗及改善睡眠作用研究

茍 歡 任柳怡 雷傳文 王 莉 賀新生 李國友 袁小紅

縱條紋炭角菌子實體的急性毒性試驗及改善睡眠作用研究

茍 歡 任柳怡 雷傳文 王 莉 賀新生 李國友 袁小紅*

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

為確定縱條紋炭角菌子實體的安全性及對改善睡眠的效應，通過急性毒性試驗評價子實體安全性，并確定最大給藥量；通過小鼠戊巴比妥鈉閾劑量（閾下劑量）催眠試驗，探究縱條紋炭角菌子實體對小鼠睡眠的效應。急性毒性試驗顯示縱條紋炭角菌子實體的最大給藥量為2 000 mg/kg，小鼠的生理狀況沒有明顯改變且在組織病理學分析中不存在毒性表現；戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗顯示該菌子實體在高劑量（2 000 mg/kg）時可以顯著增加入睡小鼠數量，延長小鼠睡眠時間并減少小鼠睡眠潛伏期（<0.01）。表明其可以用于失眠癥的治療。

縱條紋炭角菌；急性毒性試驗；改善睡眠；LD50；最大給藥量

縱條紋炭角菌Pat., Paris1: 247(1887)，屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌亞門（Pezizomycotina）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、炭角菌亞綱（Xylariomycetidae）、炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科（Xylariaceae）、炭角菌屬（Hill ex Schrank）[1]。炭角菌屬的一些真菌具有鎮靜、抗前列腺炎等多種生物活性[2]，已有很多關于其化合物的研究報道[3]。

本課題組已完成研制并優化縱條紋炭角菌子實體的規模化人工培養方法[4, 5]。經活性篩選發現，其子實體具有較強的抗菌[6]和抗腫瘤活性[7]，但缺乏安全性及藥理學的研究。本試驗研究其改善睡眠的作用，并通過急性毒性試驗，對其安全性作出評價，為臨床應用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級昆明系小白鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購于四川簡陽達碩動物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（川）2008-0005。雌雄分籠飼養，實驗室適應性飼養7天，發現所選小鼠健康狀態均良好。將小鼠置于室溫20～24 ℃，空氣相對濕度約40%，通風、光照良好的環境中飼養，任其自由飲水進食。

縱條紋炭角菌子實體（XS），由西南科技大學微生物實驗室提供，經自然風干并于50 ℃烘干后，粉碎過100目篩備用。戊巴比妥鈉（Service，上海化學試劑公司）。

1.2 儀器與設備

BS223S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），1 mL注射器，小鼠籠，小燒杯，外科器械等。

1.3 方法

（1）縱條紋炭角菌子實體急性毒性試驗。半數致死量（LD50）測定：首先探索縱條紋炭角菌子實體使實驗動物從0%到100%的死亡劑量。選取體重18～22 g小鼠30只，隨機分成5組，每組6只，雌雄各半。1～4組分別按500 mg/kg、1 000 mg/kg、1 500 mg/kg和2 000 mg/kg小鼠體重灌服縱條紋炭角菌子實體粉末懸濁液，第5組以等體積生理鹽水灌服，作為對照。觀察并記錄給藥后小鼠的反應，連續觀察7天，記錄各組小鼠的死亡情況，判定LD50。如若LD50無法測出，則測定藥物的最大給藥量[8]。

最大給藥量測定：將40只小鼠，雌雄各半，分成2組。對其中一組的20只小鼠灌服縱條紋炭角菌子實體粉末懸濁液，以該懸濁液可供灌胃的最大藥物濃度200 mg/mL為試驗給藥濃度，小鼠灌胃所能承受的最大體積10 mL/kg為試驗給藥體積，得出最大給藥量為2 000 mg/kg；另一組作對照組。記錄小鼠每天健康狀況，并于灌胃后第1天、第7天和第14天記錄小鼠體重。在第15天處死實驗小鼠，解剖摘取重要組織器官（心臟、肺、腎、肝），將其樣品固定在10％的福爾馬林緩沖液里，包埋在石蠟中，切片（厚為5 μm），染色（蘇木精、伊紅），并在光學顯微鏡下檢查[9]，觀察重要器官是否顯著改變。

（2）對戊巴比妥鈉閾劑量小鼠催眠作用的影響。將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，雌雄各半。縱條紋炭角菌子實體按高劑量組（2 000 mg/kg）、中劑量組（1 000 mg/kg）、低劑量組（500 mg/kg）進行灌胃。灌胃體積為10 mL/kg，對照組灌服等體積的生理鹽水。給藥30 min后，4組小鼠均腹腔注射35 mg/kg閾劑量戊巴比妥鈉，記錄入睡潛伏期（注射后到翻正反射消失的時間）和睡眠時間（翻正反射消失到恢復的時間）。

（3）對戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠催眠作用的影響。試驗動物分組及給藥方式同上，給藥30 min后，4組小鼠均腹腔注射25 mg/kg閾下劑量戊巴比妥鈉，小鼠翻正反射消失1 min以上即為睡眠，觀察給藥后30 min內小鼠出現睡眠的只數。

（4）統計分析。計量資料用`x±SD表示，組間差異性采用單因素方差分析和多重比較；計數資料采用2檢驗。<0.05表示差異具有顯著意義。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗結果

（1）LD50測定結果。實驗結果顯示，給藥后7天，所有組別的小鼠精神狀態均良好，食欲、皮膚、呼吸、運動等無異常，也無死亡。由于最高組使用2 000 mg/kg的劑量，是小鼠所能灌服的最大劑量，不能再加大劑量，因此均無法測得藥物的半數致死量（LD50）。

（2）最大給藥量測定結果。密切觀察給藥14天內各組小鼠的狀態，小鼠的外觀、行為活動、精神狀態、食欲、大小便顏色、被毛、呼吸、鼻、眼、口腔均無異常，體重正常（表1）。其內臟組織病理學切片均無明顯變異（圖1）。由此，得到縱條紋炭角菌子實體最大給藥量為2 000 mg/kg。

表1 灌服縱條紋炭角菌后的小鼠體重

圖1 縱條紋炭角菌對小鼠各臟器的影響（HE×200）

表2 縱條紋炭角菌子實體對戊巴比妥鈉閾劑量小鼠催眠作用的影響

注：*表示差異顯著，**表示差異極顯著；表3同。

表3 縱條紋炭角菌子實體對戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠催眠作用的影響

2.2 對戊巴比妥鈉閾劑量小鼠的催眠作用

縱條紋炭角菌高、中、低劑量組與對照組均能顯著延長小鼠的睡眠時間（<0.05，表2），劑量為2 000 mg/kg則能極顯著地縮短小鼠睡眠的潛伏期（<0.01）。

2.3 對戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠的催眠作用

縱條紋炭角菌子實體高、中、低劑量組與對照組比較（表3），小鼠的入睡數量明顯增加，表明三種劑量均具有提高小鼠睡眠率的作用；隨著劑量的增加，小鼠的入睡數量也增加。經2檢驗，高劑量組與對照組之間有極顯著差異（<0.01）。

3 討 論

小鼠急性毒性試驗是毒理學安全性評價的最基礎工作[10]，可了解受試物對機體的毒性效應，為今后的相關研究提供理論基礎。但研究發現中藥制劑的毒性很小，多數情況下無法測出其LD50，因此需要測定其最大給藥量[11]。

本研究結果表明，縱條紋炭角菌子實體的最大給藥量為2 000 mg/kg，但在此給藥劑量下，試驗動物小鼠仍未表現出中毒特征與死亡，且體重變化、內臟組織病理學切片與對照組無顯著差異，說明縱條紋炭角菌子實體對小鼠體重、臟器功能毒性較低或無毒，安全性高。

協同戊巴比妥鈉催眠模型是經典的鎮靜催眠藥效評價模型。采用戊巴比妥鈉閾下劑量進行實驗，還通過閾上戊巴比妥鈉實驗[12]，觀察小鼠的翻正反射消失情況來檢測入睡潛伏期和睡眠時間。結果表明，縱條紋炭角菌子實體具有協同戊巴比妥鈉催眠的作用，高劑量組能顯著增加小鼠入睡數量，提高入睡率，延長睡眠時間，縮短睡眠潛伏期（<0.01），證實該菌具有明顯的改善睡眠活性。

綜上可知，縱條紋炭角菌子實體安全性較高，在2 000 mg/kg的最大給藥量下小鼠仍沒有毒性表現，且具有明顯的改善睡眠活性，表明其可能用于失眠癥的治療。這一結果可為縱條紋炭角菌改善睡眠及其他生物學活性、藥理學作用研究提供基礎資料。

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[3] Silva GH, Oliveira CM, Teles HL, et al. Sesquiterpenes from Xylaria sp., an endophytic fungus associated with Piper aduncum [J]. Phytochem Lett, 2010(3): 164-167.

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[6] 袁小紅, 張春杰, 劉霞, 等. 6種高等真菌醇提物對植物病原菌的抗菌活性研究[J]. 安徽農業科學, 2013, 41(12): 5289-5290.

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Acute toxicity tests offruiting body and its effect on improving sleep

Gou Huan Ren Liuyi Lei Chuanwen Wang Li He Xinsheng Li Guoyou Yuan Xiaohong*

（College of Life Science and Engineering, Southwest University Of Science And Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China）

To investigate the safety ofand its effect on mice sleep improvement. The safety of the fruiting body ofwas evaluated by acute toxicity tests, and the maximum dose ofwas determined. The mouse pentobarbital sodium threshold dose (threshold sub-dose) hypnosis test was used to evaluate the effect of sleep in mice. Results: The acute toxicity test of fruiting body ofshowed that the maximum dose a mouse can take exceeds 2 000 mg/kg. The physiological condition of the mice did not change significantly and there were no toxic symptoms in histopathological analysis. Pentobarbital-induced sleep experiments showed that the fruiting body ofincreased significantly the number of mice, prolonged the sleep time of mice and reduced the sleep latency of mice (<0.01) in high dose of 2 000 mg/kg. Conclusion: Under the maximum dose of 2 000 mg/kg, mice showed no signs of toxicity, so the fruiting body ofis highly safefor oral administration. And it has the obvious improvement sleep activity, indicating its possible therapeutic use for insomnia.

; acute toxicity test; sleep improvement; LD50; the maximum dose

S646

B

2095-0934（2020）06-450-04

國家自然科學基金項目（21272189）；四川省大學生創新創業訓練計劃資助項目（201810619088）；中國國家轉基因重大專項（2019ZX08010-004）

茍歡，四川南充人，研究方向為天然產物化學。E-mail：1203522826@qq.com。

袁小紅，博士，教授，研究方向為天然藥物和保健食品。E-mail：419225263@qq.com。