MTHFR C667T基因多態性與反復種植失敗關系的Meta分析

羅加歡，張麗蓉，朱莉，周寧，張媛媛，張若鵬 大理大學臨床醫學院，云南大理67000；2大理大學第一附屬醫院；3大理大學生殖醫學研究所

反復種植失敗(RIF)是指年齡小于40歲的不孕癥患者經歷至少3個體外受精(IVF，包括新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植)或胞質內單精子注射(ICSI)周期,并移植了4個及以上優質胚胎而未發生胚胎著床或臨床妊娠[1, 2]。但是胚胎種植率在新鮮胚胎移植中為53.6%，在冷凍胚胎移植中僅為40.2%[1]，其中RIF占IVF的10%左右[3]。在輔助生殖技術的應用中，RIF一直是其尚未攻克的難題。RIF的病因尚不完全清楚，主要包括子宮解剖結構異常及子宮內膜厚度、免疫學因素、感染及遺傳因素。近年來研究表明，RIF的發生可能與血栓形成傾向即易栓癥相關[4]。隨著人們對基因認識的逐步深入，發現易栓癥相關基因亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C667T基因表達可能與RIF有關。但目前其相關研究樣本量小，且沒有統一結論。2020年1～3月，本研究對MTHFR C667T基因多態性與RIF患者遺傳易感性的關系進行Meta分析，為RIF的遺傳學病因提供循證醫學依據。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 通過計算機全面檢索PubMed、EMbase、Google scholar、中國知網、萬方等數據庫，搜索有關MTHFR C667T基因與RIF的研究。中文關鍵詞：“甲基四氫葉酸還原酶”“MTHFR”“基因多態性”“反復植入失敗”“反復種植失敗”，英文關鍵詞：“Methylenetetrahydrofolate Reductase”“5,10-methylenetetrahydrofolate reductase”“MTHFR”“Polymorphism, Genetic”“Genetic Polymorphisms”“Genetic Polymorphism”“recurrent implantation failure”“repeated implantation failure”“RIF”。將以上關鍵詞作為主題詞或自由詞進行檢索，并對納入文獻的參考文獻進行手工檢索，納入所缺失的文獻。檢索時間范圍從建庫至2020年1月5日。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①研究類型：病例對照研究或隊列研究，語言僅限中、英文；②研究對象：RIF組為RIF患者，對照組為年齡相匹配的首次移植成功的不孕患者或正常女性；③干預措施：RIF組和對照組均進行MTHFR C667T基因檢測；④結局指標：MTHFR C667T基因的CC、TT、CT基因型，通過基因型計算遺傳模型，包括等位基因模型(TvsC)、純合子模型(TTvsCC)、雜合子模型(TCvsCC)、主導模型(TT/TCvsCC)及隱性模型(TTvsTC/CC)。排除標準：①非原始研究(綜述、Meta分析等)、動物研究、個案報告或未發表的文章；②非中文或英文研究；③無法提取相關數據的研究；④重復發表的文獻，同一作者、同一單位選取最新、樣本量最大的文獻。

1.3 文獻篩選與資料提取 由兩位研究者按納入標準、排除標準篩選文獻及提取資料，若遇分歧則討論解決，若仍無法解決，與經驗豐富的第三人參與協商后確定。提取資料：①基本信息,包括作者姓名、發表時間、研究國家、種族及樣本量。②基因分型、基因頻率、對照組的哈迪-溫伯格均衡(HWE)。

1.4 納入研究的方法學質量評價 由兩位研究者分別用Newcastle-Ottawa量表(NOS)評價納入研究的方法學質量，NOS評分<7分定義為低質量研究，≥7分定義為高質量研究[5]。

1.5 統計學方法 采用STATA14.0統計軟件。計數資料采用比值比(OR)及其95%可信區間(CI)為效應統計量。分別用等位基因模型、純合子模型、雜合子模型、主導模型、隱性模型對致病風險進行評估。采用I2檢驗進行異質性檢驗，檢驗水準α=0.1。P≥0.1且I2≤ 50%認為各研究的異質性可忽略，采用固定效應模型，否則采用隨機效應模型。對納入研究數≥4篇的文獻按種族、HWE、對照組的納入對象進行亞組分析。逐一剔除納入文獻，進行敏感性分析，分析異質性的來源，若異質性明顯降低，說明該文獻為異質性的主要來源之一。采用Egger′s檢驗及Begger′s檢驗進行發表偏倚評估，P>0.05認為不存在偏倚，研究結果受發表偏倚影響的可能性較小，否則認為存在發表偏倚。

2 結果

2.1 文獻篩選結果 初檢文獻91篇，剔除重復及不相關文獻，最終納入文獻10篇[4, 6～14]，共2 024例，其中RIF組939例、對照組1 085例。

2.2 納入研究的基本特征及方法學質量評價 見表1。

表1 納入研究的基本特征及方法學質量評價結果

2.3 Meta分析結果

2.3.1 兩組MTHFR C667T基因模型比例分析 隨機效應模型Meta分析結果顯示，與對照組比較，RIF組MTHFR C667T等位基因模型比例升高(OR=1.353、95%CI為1.053～1.737、P=0.018)，隱性模型比例差異無統計學意義(OR=1.500、95%CI為0.966～2.328、P=0.071)。固定效應模型Meta分析結果顯示，與對照組比較，RIF組MTHFR C667T純合子模型比例升高(OR=1.629、95%CI為1.205～2.204、P=0.002)、主導模型比例升高(OR=1.345、95%CI為1.105～1.637、P=0.003)，雜合子模型比例比較差異無統計學意義(OR=1.236、95%CI為1.000～1.527、P=0.050)。見表2。

表2 MTHFR C667T基因多態性與RIF關系的合并統計量及發表偏倚分析結果

2.3.2 MTHFR C667T等位基因模型、隱性模型與RIF關系的亞組異質性分析結果 ①MTHFR C667T等位基因模型與RIF關系的亞組異質性分析結果：亞洲人(I2=36.6%，P=0.206)的異質性明顯低于高加索人(I2=67.4%，P=0.005)，HWE≥0.1(I2=59.0%，P=0.017)與HWE<0.1(I2=77.2%，P=0.036)的異質性比較無明顯差異；對照組正常女性的異質性明顯降低(I2=0.0%，P=0.605)且統計合并量發生了質的改變(OR=1.130，95%CI為0.937～1.363，P=0.201)，異質性主要來源于首次移植成功的不孕患者(I2=75.0%，P=0.003)。見表3、圖1。敏感性分析結果：去除Ahmad等[13]的文獻后異質性(I2=35.8%，P=0.132)明顯降低，且統計合并量未發生質的改變，即該文獻為異質性的主要來源之一。見圖2。②隱性模型與RIF關系的亞組異質性分析結果：亞洲人(I2=59.3%，P=0.086)的異質性明顯高于高加索人(I2=49.6%，P=0.064)，HWE≥0.1(I2=44.4%，P=0.083)的異質性明顯低于HWE<0.1(I2=79.1%，P=0.029)；對照組正常女性的異質性(I2=57.8%，P=0.050)明顯低于首次移植成功的不孕患者(I2=30.7%，P=0.217)。見表4。敏感性分析結果顯示分別去除任何一篇文獻的異質性改變均不明顯，見圖3。

表3 MTHFR C667T等位基因模型與RIF關系的亞組異質性分析結果

圖1 MTHFR C667T等位基因模型與RIF關系的亞組異質性Meta分析結果

2.4 發表偏倚分析結果 Egger′s法檢驗結果顯示，RIF與MTHFR C667T等位基因模型、純合子模型、隱性模型的關系時可能存在發表偏倚；Beger′s檢驗結果顯示，RIF與MTHFR C667T等位基因模型的關系可能存在發表偏倚(P均<0.05)。其余各相關研究均不存在發表偏倚(P均>0.05)。見表2。

3 討論

MTHFR是葉酸代謝通路中的關鍵酶，可將5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，而5-甲基四氫葉酸參與同型半胱氨酸(Hcy)的代謝，維持血漿Hcy的正常水平[15, 16]。MTHFR基因位于染色體1p36.3，包含11個外顯子，其中以第5外顯子677基因位點發生C-T突變最為常見。該突變使其編碼的纈氨酸被丙氨酸替代，導致MTHFR的活性和耐熱性下降，血漿Hcy水平增加。而Hcy水平升高易導致高同型半胱氨酸血癥，可造成血管內皮細胞損傷、剌激血管平滑肌細胞增生導致絨毛血管化(形成)不良，以及破壞機體凝血和纖溶系統使機體處于血栓前狀態(易栓癥)[16～18]。相關研究發現，易栓癥患者子宮內膜血管易形成微小血栓，導致其容受性紊亂，致使胚胎著床障礙或者著床后胎盤循環建立不良，從而影響胚胎植入[4, 19～21]。而導致易栓癥的原因很多，具體哪種因素導致胚胎植入失敗尚不明確，同時關于MTHFR基因與RIF是否相關仍存在爭議。

圖2 去除Ahmad等文獻后MTHFR C667T等位基因模型與RIF關系的敏感性分析結果

表4 MTHFR C667T隱性模型與RIF關系的亞組異質性分析結果

圖3 MTHFR C667T隱性模型與RIF關系的敏感性分析結果

本Meta分析結果顯示，與對照組相比，RIF組MTHFR C667T基因多態性在等位基因模型中的差異有統計學意義，說明MTHFR C667T等位基因模型是RIF的易感基因模型。亞組分析發現，亞洲人群與RIF發病風險相關，與高加索人群無明顯相關性；表明人種(地域)可能造成MTHFR C677T的突變差異，這與Qublan等[8]的結論一致。按對照組的納入對象進行亞組分析發現，異質性主要來源于首次移植成功的不孕患者，其原因可能為患者有可能是由于男性因素、輸卵管因素或者卵巢因素等原因而進行移植，導致異質性很大；但在自然受孕的正常女性中，發現RIF與自然受孕相比無明顯差異，而在首次移植成功的不孕患者與RIF患者之間差異有統計學意義，說明在首次移植成功的不孕患者中可能發生了MTHFR C677T基因突變。敏感性分析發現，Ahmad等[13]的文獻為異質性的主要來源，其可能的原因是該文獻將RIF定義為2次及以上植入失敗，與其他研究相比增加了進入RIF組的概率，導致假陽性率增加，使對照組與RIF組差異減小；但該研究樣本量少，故未改變研究結果的方向。

本研究結果表明，MTHFR C667T基因中純合子模型及主導模型是RIF患者的易感因素，而雜合子模型及隱性模型則與RIF無明顯相關性。這說明在MTHFR C667T的基因型中，與CC基因型相比，TT基因型可增加RIF患者的遺傳易感性。分析其可能的機制，MTHFR C667T突變可導致Hcy水平升高，造成血管上皮細胞損傷而發生易栓癥，易栓癥導致微小血栓而造成子宮內膜血供不足，最終影響胚胎植入。Hcy水平升高可造成血管上皮細胞損傷，Hcy超過一定濃度可能會對胚胎細胞造成損傷，導致胚胎發育延遲或者停滯，最終導致RIF。而TC基因型尚不能認為可增加RIF的遺傳易感性，說明RIF患者的MTHFR C667T突變為隱性突變，即只有當其基因突變為TT基因型時才能增加RIF患病風險。

綜上所述，MTHFR C667T的TT基因型可增加RIF的發病風險，TC基因型可能與RIF的發病無關。但是由于種族、地域的差異性，尚需國內外開展高質量、多中心的臨床研究予以驗證。本研究的局限性：①由于語言的限制，本研究僅納入了中、英文文獻，導致資料收集不全面，可能造成語言偏倚；②未對灰色文獻納入分析，可能造成發表偏倚；③個別研究未直接提供所有數據，部分數據計算得出，與真實值可能存在一定誤差。