功能酵素的研究進展

吳 紅，雷于國，胡國元*

1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢430205；

2.湖北裕國菇業股份有限公司，湖北 隨州441300

酵素是以動物、植物、菌類等為原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分的產品，其中含各種活性物、生物酶以及益生菌，具有豐富的營養和較高的經濟價值［1-2］。我國的豆豉、泡菜、豆腐乳等也屬酵素食品［3］。2018年中華人民共和國工業和信息化部頒布的《酵素產品分類導則》規定酵素按產品應用領域可分為食用酵素、飼用酵素、農用酵素、日化酵素、環保酵素及其他［1］。在我國，酵素產品價格偏高，在人群中的普及率和認可度較低，原因是我國關于酵素的研究仍然處于起步階段，酵素的菌種篩選鑒定方法存在不足，酵素的制備工序大多是優化其發酵條件，檢測產物在發酵過程中的含量變化。對于原料配比研究較少，酵素功能的研究主要傾向于食用酵素，處在體外試驗階段且關于抗氧化功能的研究居多，臨床試驗的研究偏少，其他類型酵素的研究處于邊緣位置，需要大力研發并發揮其潛在的作用。另外，在宣傳酵素產品的過程中存在不當宣傳，其市場規范和法律法規方面有待改進。在此背景下，本文綜述了酵素發酵菌種的篩選、微生物在發酵過程中的變化、酵素的發酵工藝和發酵機制、功能應用、安全問題以及市場規范，為酵素的相關研究提供科研思路，有利于酵素產業化發展。

1 酵素發酵的菌種和發酵過程中微生物的變化

1.1 酵素發酵菌種的分離

自然酵素發酵中的微生物種類繁多，相互作用及菌落結構變化復雜，且從自然酵素中分離出的微生物最普遍的是酵母菌、乳酸菌［4］、沙如意等［5］，從自然發酵的水果酵素中篩選出的丘陵假絲酵母可以在起始pH值為1.5的發酵液中生長，并且篩選出的菌株均具有耐高糖和耐低pH值的特性。Prado等［6］從經過自然發酵的椰子水中分離一株植物乳桿菌AC-1，對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃葡萄球菌有抑制作用，且在胃腸道條件下存活率更高。Giri等［7］從越南傳統大米發酵飲料中分離出的植物乳桿菌L7在體外具有耐酸、膽汁耐受性和抗菌等特性。

從自然發酵酵素中分離優良的酵素菌種，利用基因工程技術改良得到食品工業用菌種［8］以及采用雜交育種獲得的菌種都可以用于酵素發酵，同時，采用上述基因工程技術或雜交育種上游技術結合下游的酵素發酵技術為酵素產業創新發展提供一種新的途徑。

1.2 酵素發酵過程中微生物的變化

近年來，許多研究開始從基因組學和宏基因組學等方面入手，采用高通量測序技術對所獲樣本的信息進行對比分析，研究酵素發酵過程微生物多樣性以及相關變化規律。齊天翊［9］通過高通量測序技術對4個不同發酵時段果蔬酵素中微生物群落結構變化進行比較，最終確定乳桿菌為優勢菌群，最佳發酵周期為20 d，致病菌豐度最低。邸鵬月等［10］從桑葚酵素發酵過程中提取到的樣本進行高通量測序及分析發現：乳桿菌屬是桑葚酵素發酵過程中的優勢菌，根據得到的數據推測發酵過程分為不同的階段。微生物在發酵過程中的變化規律可以顯示出酵素發酵的特點，以便于調整發酵周期，積累更多發酵產物，避免污染［11］。

自然酵素發酵體系中微生物種類甚多，可作為人工接菌酵素發酵菌種的重要來源，對其加大開發力度，并廣泛運用，利于酵素發酵過程的科學管控，得到高質量酵素產品。

2 酵素的發酵工藝和發酵機制

2.1 酵素的發酵工藝

因原料種類豐富，產地不同，酵素制備要根據原料所含營養成分和用量來“量身定制”一套發酵工藝，以得到最大效益。酵素主要的發酵模式分為兩類：傳統的自然發酵和現代化的接菌發酵［12］。

2.1.1 自然酵素的發酵工藝早期的自然酵素發酵都是憑借環境和原料自帶的微生物進行發酵，如薛淑龍等［13］將竹葉和適量水放入干凈無菌的發酵罐里，密封放置于干燥陰涼處發酵230 d。晏殊［14］用無菌水將9種水果洗凈，進行去皮去核并切塊處理，按質量比1∶1與白糖混合并打漿，再放入滅菌后的玻璃瓶中，室溫下密封發酵180 d。隨著研究的進行，研究發現傳統的自然發酵工藝周期較長，可變因素對酵素的發酵過程影響較大，發酵條件不受控制，導致發酵失敗。使自然酵素發酵條件從啟動發酵至終止發酵都保持不變，為保證發酵成功提供一個新的思路。張艷明等［15］以牛蒡、山藥為原料，優化原料配比，控制溫度和發酵時間，其發酵周期縮短，酵素口感柔和且風味獨特。郭俊花等［16］利用蘋果皮渣制備天然酵素并優化工藝條件，其最佳發酵條件為蘋果皮渣添加量為400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH為5.5、發酵時間150 d，該酵素可用于紅富士蘋果的生長，使單果品質有所提高。

2.1.2 人工接菌酵素的發酵工藝人工接菌酵素發酵工藝是將酵母菌、乳酸菌等接種至原料中，控制發酵條件。戰偉偉等［17］將合適比例的酵母菌與雙歧桿菌接入藍靛果與椰子果漿，發酵溫度33℃，發酵時間70 d，最終得到藍靛果椰子酵素總黃酮含量為20.31 mg/g、SOD酶活力為56.74 U/mL。舒旭晨等［18］利用酵母菌和乳酸菌復合發酵石斛，發酵溫度31℃，發酵時間8 d后酵素羥自由基清除率為34.79%，且比單菌發酵更具有明顯優勢。

后續研究還出現一些較為系統且工序復雜的酵素制備方法，李凡等［19］將白首烏洗凈，經過液化糖化、滅菌等處理后得到首烏汁，首先接入體積分數0.2%酵母菌，發酵24 h；再接入體積分數3%復合乳酸菌；在4～8℃后發酵12 h，最后得到首烏酵素SOD酶活力達到4.23×104U/L，且含大量活菌，首烏的異味得到改善。莫大美等［20］以玫瑰花為原料，先接入1.99%的酵母菌進行發酵之后，接著接種1.27%的乳酸菌，再在優化基礎上接種2%醋酸菌繼續發酵20 d，得到玫瑰花酵素SOD酶活達245.3 U/mL，且酵素口感酸甜適宜。

目前對酵素原料配方的研究報道比較少，喬沈［21］添加生物硒制備生物硒蔬菜酵素，其抗氧化能力比普通無硒酵素強。楊婧娟等［22］采用最優混料設計法優化原料配方，增強酵素抗氧化和抑菌作用。劉敏等［23］經過比較水果、蔬菜、中草藥等不同原料組合發酵，證明酵素中活性物質含量及抗氧化性隨著物料的添加量和品種的增加而升高，單一的蔬菜酵素活性物質最少。

2.1.3 自然發酵與接菌發酵工藝自然酵素的發酵工藝類似于傳統發酵，目前存在一定的缺陷，而人工接菌發酵工藝雖然從某些方面講更具優勢，但仍然存在不足。梅子龍等［24］以大球蓋菇為原料，分別進行自然發酵和人工接菌發酵，結果表明人工接菌發酵的酵素比自然發酵具有更強的抗氧化能力，脂肪酶和淀粉酶活有所提高，有機酸種類增加，而蛋白酶和纖維素酶活力、乳酸和總酸含量比自然酵素低。肖夢月等［25］在自然拐棗酵素中篩選分離獲得釀酒酵母和植物乳桿菌各1株，再接種至拐棗進行人工接菌發酵，發酵時間明顯縮短，對糖的使用量也大大減少。自然酵素發酵過程不易控，接菌發酵工藝發酵周期相對較短，發酵過程穩定。這兩種發酵方式在產業化發展中仍需進一步對比研究，有利于酵素制備產業創新性發展。

2.2 酵素的發酵機制

目前的研究主要是對發酵產物檢測之后進行對比分析，發掘發酵菌種的發酵特性，有利于充分理解并掌握酵素的發酵機制。如酵母菌是兼性厭氧菌，在酵素發酵過程中將可發酵糖轉化為乙醇、水和CO2，在合適的條件下還能產生乳酸、酒石酸、蘋果酸等［26］。韋仕靜［27］研究桑葚酵素發酵過程中植物乳桿菌對花青素的轉化，初步發現：原兒茶酸是花青素的轉化產物之一，隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸并非桑葚酵素中花青素的轉化產物，后經過液質分析發現，除原兒茶酸外，桑葚中的花青素經植物乳桿菌發酵后新增了8種酚酸，初步確定為桑葚酵素花青素的轉化產物。Kaprasob等［28］利用5種益生菌分別進行發酵腰果梨汁，在整個發酵過程中，嗜酸乳桿菌自身具有合成維生素B1（Vita?min B1，VB1）的能力，不需要VB1也可以生長，因此可使發酵腰果梨汁中的VB1含量保持較高水平。微生物代謝途徑存在差異，發酵產物變化較大，從微生物代謝的角度研究酵素的發酵機制，并應用于工業化生產，促進酵素產品的品質，以滿足人們對于健康飲食的需求［26］。

3 酵素產品的功能

酵素中含有不同種類活性物質，從而具備不同生物功效（見表1），為食品行業、種植業、養殖業以及日化行業帶來福音，既迎合了現代人對健康生活追求，也符合農業綠色可持續發展觀念。相關研究表明食用酵素作為發酵功能食品具有輔助人們預防多種疾病，補充營養，促進人體健康的潛在價值，但是其作用機理、臨床試驗等方面仍需進一步研究。在開發新型功能酵素的過程中，一方面是探索新的發酵菌種，另一方面是在自然界尋找發現含有特殊功能活性成分的酵素原材料，從而開發出新型功能酵素，為人們的生產生活提供更多的便利。酵素除了在食品領域有突出貢獻，還在動物飼料添加、促進作物生長和土壤改良以及日化領域都有重要的應用。

表1不同類型酵素的功能Tab.1 Functions of different types of Jiaosu

4 酵素產品的安全性和質量規范

我國對于酵素的研究逐漸擴展，但還未對酵素品質出臺相關規范制度，酵素制備工藝及檢測方法不夠完善統一［45］。市場上酵素產品種類五花八門，價格不菲，質量不過關，功效被過度宣傳，給消費者、生產者以及市場監管者帶來多種不必要的麻煩。

4.1 酵素產品的安全性

酵素發酵工藝主要存在生物危害和化學危害2種。生物危害涉及到有毒或致病雜菌污染及菌種變異等，化學危害則是農藥殘留及重金屬、化學試劑的混入［46］。酵素發酵過程可能存在雜菌污染，或者物質經過微生物轉化可能產生有害物質，最終導致酵素質量不合格。除不斷改進工藝技術，監測發酵過程外，原料處理以及發酵罐設計也十分必要，最終都是要保證酵素產品的安全性，使消費者放心使用酵素產品。

4.2 酵素產品的質量規范

當前各企業及高校簡化酵素發酵過程，追根溯源研究其明確的成分及功能［47］，以提升其品質。酵素質量評價標準還未完成，成分鑒定及檢測方法標準未統一［48］。2018年中華人民共和國工業和信息化部頒布的《植物酵素》《酵素產品分類導則》中關于酵素的檢測方法尚不明確，有待細化和完善。一方面，各科研機構共同研究和努力，不斷地提升酵素發酵工藝技術，提高并穩定酵素產品質量，另一方面，隨著國家加大對酵素市場的監管力度，進一步完善法律法規和酵素的相關質量檢測標準，規范商家的不當宣傳行為，讓人們對酵素有一個正確的認識，從而促使酵素產業發展良好，為人們提供更多消費選擇，利于酵素產業長期發展。

5 結論

當前關于酵素的研究正逐漸多樣化，從優良菌種選育到工藝優化，以及發酵機制和功能作用等方向擴展和深入研究，最近幾年，還成立了中國生物發酵產業協會酵素分會，并且制定了關于酵素的行業標準，且每年各地還舉辦了關于酵素的博覽會，有利于大眾對其有一個更為清楚的認識。為使酵素成為讓消費者放心使用的綠色健康產品，形成一條從源頭到市場的完整的生產銷售產業鏈條，在市場上占據足夠的優勢，仍需做以下思考和研究：

1）從酵素的配方、菌種培育和選用、發酵工藝、功能效用以及產品保存等幾個主要方面入手，利用更新發展的相關技術輔助酵素的發酵，研究的主要目的在于弄清楚酵素的主要作用成分及發酵菌種在發酵過程中的代謝產物，酵素的作用機制，并掌握一套成熟的發酵工藝，以便于工業化生產。

2）市場的嚴格監管和把控也需要跟上酵素產業發展的腳步，逐步統一和完善酵素的質量和安全標準，從生產到運輸和保存以及銷售都要有明確的規定，不同類型的酵素必須滿足一定條件才可投入生產進行銷售，酵素的作用成分需明確標明，必要時標明適宜人群和注意事項，在銷售過程中不能進行誤導宣傳。

3）本土酵素的研制在不同程度需依托各個學科方面的知識和技術，從而降低酵素生產成本和提升酵素品質，擺脫對進口酵素產品的依賴，增強國民對本土酵素產品的信心，對此，我國酵素產品的自主研發和生產就顯得極為必要。