電針預處理對兔脊髓缺血再灌注損傷后炎性因子的影響

姚夢莉，陳向華，陳朝暉*，王 海

1 安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥230038；2 安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥230038；3 徐州市中醫(yī)院，江蘇 徐州221000

* 通信作者：陳朝暉，E-mail：czhn007@163.com

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemic reperfusion injury，SCII）是脊髓組織經(jīng)歷一段時間缺血再次恢復血供后，脊髓組織功能結構損傷加重，甚至脊髓神經(jīng)元發(fā)生不可逆性損傷［1］。 它是一種嚴重的繼發(fā)性損傷，是臨床上造成主動脈瘤、脊柱骨折、骶管腫瘤等手術術后截癱的最主要原因，其發(fā)生率可達10%～40%，對患者的身心健康造成嚴重危害。SCII 與脊髓組織的原發(fā)性損傷不同，其屬于二次損傷，具有可預見性，因此早預防、早治療十分必要。已有研究證實，炎癥反應是影響SCII 病理進程的重要因素［2］，因此抑制炎癥反應是治療SCII 的可行策略之一。 目前電針廣泛應用于脊髓損傷的臨床治療，療效顯著，對于其在SCII 的應用多集中于基礎研究［2-3］。有研究表明，電針具有減輕炎癥反應、緩解疼痛，改善脊髓水腫、保護神經(jīng)元等功效［4］。功能性磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，fMRI）和彌散張量纖維束成像（diffusion tensor imaging，DTI）則顯示［5-6］，電針可激活脊柱功能區(qū)，調(diào)整脊柱纖維束形態(tài)，恢復脊柱功能結構。 本研究通過電針預處理SCII 模型兔，觀察不同時點白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等致炎因子和白細胞介素-1 受體拮抗劑（IL-1Rα）抗炎因子的變化，進一步明確電針預處理SCII 的免疫機制，為臨床治療SCII 提供依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供成年健康SPF 級新西蘭大白兔24 只，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食，體質量2.0～2.5 kg。 實驗遵循《實驗動物管理與使用指南》［7］，并通過安徽中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會批準（批號：AHUCM-rabbits-2019010）。

1.2 主要實驗試劑與設備

烏拉坦（武漢久安藥業(yè)有限公司）；30%過氧化氫（武漢久安藥業(yè)有限公司）；DAB 染色劑和IL-1β+bs-0812R（均購自上海蘇懿化學試劑有限公司）；兔IL-1β 試劑盒、兔IL-6 試劑盒、兔TNF-α 試劑盒、兔IL-1Rα 試劑盒（均購自上海三發(fā)科學儀器有限公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司，Nikon牌）；毫針（合肥有為康設備有限公司，華佗牌1.5 寸）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，RT-6000）；電針儀（合肥有為康設備有限公司，SDZ-II型）。

1.3 分組及模型制備

1.3.1 實驗分組 將24 只新西蘭大白兔按照隨機數(shù)字表法分為模型組、假手術組、電針組，每組8 只。

1.3.2 模型制備 采用Zivin 法［8］進行造模。 術前禁食12 h。 20%的烏拉坦（6 mL／kg）耳緣靜脈注射麻醉，兔仰臥位固定，手術范圍內(nèi)備皮，常規(guī)消毒，氣管插管，保持呼吸道。 距兔劍突下約1 寸處行腹部正中切口，切口長度約3～4 cm，清潔紗布包裹大網(wǎng)膜和胃腸管，推開并暴露腹主動脈，鈍性分離約0.5 cm，以腎上腺為標志，靠近右腎動脈的近心端起始部夾閉腹主動脈，當觸及腹主動脈遠端波動感消失開始計時，用血管鉗把切口進行臨時夾閉，30 min后取出動脈夾，確定腹主動脈遠端搏動恢復后，無菌紗布清除腹腔滲出液，復位胃腸等器官，逐層縫合，關閉腹腔。 假手術組不夾閉腹主動脈，其余步驟相同。 保持室內(nèi)溫度22 ℃，注意動物保暖直至清醒，術后予以青霉素抗感染治療4 d，正常飲水攝食。

1.4 實驗動物處理

1.4.1 模型組 造模成功后，連續(xù)4 d 給予青霉素20 萬U／d 肌肉注射，飼料喂養(yǎng)，正常飲水、自由活動。

1.4.2 假手術組 模型制備及實驗動物處理同模型組，但不夾閉腹主動脈。

1.4.3 電針組 兔脊髓缺血再灌注模型誘導前30 min進行電針干預治療，采用SDZ-II 型電針儀，參照《實驗針灸學》［9］的操作方法，針刺雙側“懸鐘”和“陽陵泉”2 個穴位。電針參數(shù)：疏密波，10 Hz，電針強度要讓肢體保持輕微顫動，治療時間為30 min［10］。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-1Rα 檢測 分別于造模前0 h 及缺血再灌注后4、8、12 h 這4 個時間點采集兔股靜脈血2 mL 于試管中，靜置30 min后以3 000 r／min 的速度將血液離心20 min，然后移液器取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存待測。采用ELISA 法檢測血清 中IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-1Rα 的表達，檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 脊髓組織變化觀察 取血完成后采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死兔，確定L2～5的位置，使用咬骨鉗咬斷棘突和椎板，手術刀清理脊柱周圍軟組織，手術剪剪斷附著的脊神經(jīng)根，取出L2～5段的脊髓組織后，用生理鹽水沖洗干凈，固定于10%的福爾馬林溶液中，再經(jīng)過脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋等步驟將標本制作成蠟塊，切片，厚度約為5 mm，行蘇木精-伊紅染色（HE 染色），光學顯微鏡下觀察脊髓組織變化并采集照片。

1.5.3 IL-1β、IL-6、TNF-α 定位及表達檢測 取上述蠟塊，切片、脫蠟，3% H2O2水孵育5 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗干凈，滴加一抗后PBS 沖洗，接著滴加二抗室溫孵育10 min，PBS 再次沖洗，然后使用DAB 溶液讓脊髓組織顯色，經(jīng)過沖洗、復染、脫水、封片步驟，最后在光學顯微鏡下觀察并采集照片。 兔脊髓組織中IL-1β 的表達以間質及胞漿被染成棕褐色為陽性表達，IL-6、TNF-α 的陽性表達則為神經(jīng)元胞漿及突起中被染成棕褐色。

1.6 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 計量資料服從正態(tài)分布采用（±s）表示，各組兔血清中多時點炎癥因子含量符合正態(tài)分布，采用重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；各組兔脊髓組織中蛋白平均灰度值滿足獨立、正態(tài)、方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3 組兔脊髓組織形態(tài)學變化

研究結果顯示，假手術組兔脊髓組織中神經(jīng)元輪廓清晰，胞體較大且圓潤，胞漿染色均勻，胞核及核仁完整清楚，樹突、軸突完整存在，整個組織的結構較為清楚、完整。 模型組兔脊髓組織中神經(jīng)元數(shù)目減少，細胞胞核及胞漿染色變淺，胞核固縮或消失，核膜的邊界不清晰，或者核破碎、或者核溶解甚至出現(xiàn)核仁消失，軸突出現(xiàn)擴大或腫脹或消失等病理改變，神經(jīng)細胞的周圍存有透亮區(qū)，甚至壞死后留下空腔。 與模型組比較，電針組神經(jīng)元的數(shù)目增加，變形、壞死減少，其結構也更為清晰，細胞胞核及胞漿染色變深，胞核及核仁輕度腫脹，萎縮減輕，神經(jīng)元的存活密度增加，整體破壞程度減輕。 見圖1。

圖1 3 組兔脊髓組織病理顯微結構（HE 染色×400）Figure 1 Pathological microstructure of spinal cord tissue in three groups of rabbits （HE staining×400）

2.2 3 組兔炎癥因子表達變化

2.2.1 3 組IL-1β 含量比較 見表1。

2.2.2 3 組IL-6 含量比較 見表2。

2.2.3 3 組TNF-α 含量比較 見表3。

表1 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷IL-1β 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 1 Comparison of IL-1β level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表1 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷IL-1β 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 1 Comparison of IL-1β level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：與模型組缺血前比較，1） P＜0.05；與假手術組同一時間點比較，2） P＜0.05；與模型組同一時間點比較，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

組別假手術組模型組電針組n 8 8 8缺血前24.38±1.49 24.42±2.20 24.16±1.59再灌注后4 h 23.86±1.09 42.90±1.971）2）28.36±1.002）3）8 h 25.10±1.05 66.24±1.761）2）37.97±1.352）3）12 h 24.83±1.38 67.53±2.071）2）41.03±1.592）3）

2.2.4 3 組IL-1Rα 含量比較 見表4。

2.3 3 組兔促炎因子定位及表達變化

假手術組無特殊陽性表達，著色均勻。 模型組胞核著色不均或不著色，IL-1β 大量表達在細胞間質及胞漿中，IL-6 和TNF-α 則大量表達在神經(jīng)元胞漿及突起中。 電針組間質及胞漿中IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達明顯減少，見圖2、圖3、圖4。 與假手術組同一時間點比較，模型組與電針組IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量表達均明顯上升，模型組含量最高，電針組次之；與模型組同一時間點比較，電針組IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表5。

表2 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷IL-6 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 2 Comparison of IL-6 level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表2 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷IL-6 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 2 Comparison of IL-6 level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：與模型組缺血前比較，1） P＜0.05；與假手術組同一時間點比較，2） P＜0.05；與模型組同一時間點比較，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

組別假手術組模型組電針組n 8 8 8缺血前123.51±4.66 119.47±5.63 120.85±3.70再灌注后4 h 121.92±2.67 174.24±6.021）2）193.74±2.522）3）8 h 125.97±3.74 205.40±4.251）2）231.91±3.272）3）12 h 127.78±1.82 252.77±3.421）2）227.24±2.252）3）

表3 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷TNF-α 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 3 Comparison of TNF-α level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表3 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷TNF-α 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 3 Comparison of TNF-α level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：與模型組缺血前比較，1） P＜0.05；與假手術組同一時間點比較，2） P＜0.05；與模型組同一時間點比較，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

組別假手術組模型組電針組n 8 8 8缺血前173.28±3.40 170.90±6.67 172.24±5.04再灌注后4 h 176.31±4.37 438.14±5.121）2）376.95±4.572）3）8 h 174.43±3.92 479.51±4.281）2）416.88±2.832）3）12 h 176.54±4.93 447.66±8.501）2）380.78±8.862）3）

表4 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷IL-1Rα 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 4 Comparison of IL-1Rα level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

表4 3 組兔脊髓缺血再灌注損傷IL-1Rα 水平比較（±s） 匹克／毫升Table 4 Comparison of IL-1Rα level in spinal cord ischemia-reperfusion injury of rabbits in three groups （±s）pg／mL

注：與模型組缺血前比較，1） P＜0.05；與假手術組同一時間點比較，2） P＜0.05；與模型組同一時間點比較，3） P＜0.05。Note: Compared with the model group before ischemia, 1) P＜0.05; Compared with the sham operation group at the same time,2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time, 3) P＜0.05.

組別假手術組模型組電針組n 8 8 8缺血前97.20±2.68 98.00±3.19 97.37±4.96再灌注后4 h 99.47±3.15 131.07±2.981）2）148.46±8.152）3）8 h 98.86±2.96 136.24±4.311）2）133.75±7.832）12 h 96.15±2.17 101.13±2.87 108.05±3.222）

圖2 3 組兔脊髓組織IL-1β 陽性表達（×200）Figure 2 Positive expression of IL-1β in spinal cord tissue of rabbits in three groups (×200)

圖3 3 組兔脊髓組織IL-6 陽性表達（×200）Figure 3 Positive expression of IL-6 in spinal cord tissue of rabbits in three groups (×200)

圖4 3 組兔脊髓組織TNF-α 陽性表達（×200）Figure 4 Positive expression of TNF-α in spinal cord tissue of rabbits in three groups (×200)

表5 3 組兔脊髓IL-1β、IL-6、TNF-α 陽性AOD 值比較（±s）Table 5 Comparison of positive AOD values of IL-1β，IL-6 and TNF-α in spinal cord of rabbits in three groups （±s）

表5 3 組兔脊髓IL-1β、IL-6、TNF-α 陽性AOD 值比較（±s）Table 5 Comparison of positive AOD values of IL-1β，IL-6 and TNF-α in spinal cord of rabbits in three groups （±s）

注：與假手術組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

TNF-α 0.23±0.002 2 0.49±0.001 31）0.33±0.002 41）2）組別假手術組模型組電針組n 5 5 5 IL-1β 0.36±0.002 8 0.48±0.002 81）0.39±0.002 61）2）IL-6 0.35±0.003 0 0.44±0.004 11）0.39±0.002 91）2）

3 討 論

炎癥因子分為促炎因子和抑炎因子兩部分，在發(fā)生損傷的早期階段，機體會分泌適量的促炎因子建立防御機制，抵御傷害。 在各種因素的影響下，機體自身的調(diào)節(jié)功能失衡，會產(chǎn)生過量的促炎因子，引起瀑布樣炎癥反應，導致炎癥反應失控，引發(fā)全身炎癥反應綜合征，甚至多器官功能障礙綜合征等嚴重后果，造成器官和軀體損害。 SCII 就是脊髓炎癥反應失控的一種表現(xiàn)，在脊髓缺血再灌注過程中，免疫炎癥反應傾向于造成脊髓損傷。

3.1 脊髓缺血再灌注損傷后TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-1Rα 等炎癥因子表達明顯上升

ELISA 法檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 與抑炎因子IL-1Rα 在再灌注4、8、12 h 均有不同程度的上升；此外，免疫組化分析結果顯示模型組促炎因子表達也明顯上升，其表達位置集中在神經(jīng)元胞漿中。 這提示促炎因子與抑炎因子均參與了脊髓炎癥反應。 炎癥反應發(fā)生可能會造成脊髓組織損傷， 本研究的HE 染色結果證實了這一觀點。 模型組兔脊髓組織光鏡下顯示脊髓組織中神經(jīng)元數(shù)量減少，細胞胞核及胞漿著色較淺，胞核固縮或消失等病理變化。 IL-1Rα 是一種天然抗炎劑，其與IL-1β 受體結合切斷IL-1β 生物活性，具有很好的抗炎作用。IL-1Rα 水平在再灌注后4 h 有明顯表達，再灌注后8 h 時達到高峰，再灌注后12 h 時呈下降趨勢；而IL-1β 在再灌注后4、8、12 h 均上升，但在再灌注后12 h 時上升幅度減小，證實IL-1Rα 對IL-1β 具有明顯抑制作用，這提示IL-1Rα 只在再灌注后8 h 內(nèi)發(fā)揮最大的保護作用，因此其抗炎作用有限。

TNF-α 作為機體內(nèi)多種細胞因子的啟動因子，具有協(xié)同放大炎癥級聯(lián)反應的作用［11］。 本研究結果顯示，模型組TNF-α 的表達在再灌注后8 h 達最高峰，這與蘇權等［12］研究結果一致。 而安民等［13］實驗研究結果則顯示，脊髓組織中的TNF-α 在再灌注后6、12、24 h 均保持高水平的表達，在再灌注后12 h 時達最高峰，這種差異可能與檢測材料、觀察時間點不同有關。 這提示，TNF-α 在不同時間點脊髓炎癥反應中均具有重要的意義。在再灌注后4、8、12 h 3 個時間點TNF-α 的變化規(guī)律與IL-1Rα 一致，但這種變化規(guī)律究竟是由于IL-1Rα 的影響，還是TNF-α 本身的變化規(guī)律尚不明確，需要后續(xù)進一步研究。

IL-6 是具有促炎作用的細胞因子，在SCII 早期即有明顯表達，可以進一步加劇炎癥反應，損傷脊髓［14］。 本研究結果顯示，IL-6 在再灌注后4、8、12 h 3 個時間點的表達均呈現(xiàn)上升趨勢，這與TNF-α的變化趨勢不同。 這提示，IL-6 在脊髓炎癥反應中可能發(fā)揮更重要的作用。 因此，平衡炎癥因子表達，抑制炎癥反應是減輕脊髓缺血再灌注損傷的主要策略。

3.2 電針預處理干預有助于抑制脊髓缺血再灌注損傷后炎癥反應

本研究結果顯示，與模型組同一時間比較，電針組IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達均明顯改變，再灌注損傷后4、8、12 h 電針組IL-1β、TNF-α 表達均明顯降低，而IL-6 在再灌注損傷后4、8 h 表達明顯上升，12 h 表達明顯下降，這提示電針可有效抑制IL-1β、TNF-α 的表達，具有良好的抑炎作用，但對IL-6 的抑制作用不明顯；與模型組再灌注4 h 比較，電針組IL-1Rα 的表達上升，之后呈逐漸降低趨勢，這與IL-1β、TNF-α 的表達趨勢相反，這提示電針促進IL-1Rα 的表達具有時間窗效應。 因此，臨床上可以通過電針療法抑制炎癥反應，有效減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損害，保護脊髓組織，但在治療時應注意時間窗效應。

HE 染色結果顯示，與模型組比較，電針組脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量增加，細胞胞核、核仁萎縮減輕，細胞破壞程度下降等良好變化，這與唐能能等［15］的研究結果一致。 這可能與本研究充分發(fā)揮針與電的雙重作用，從而提高治療效果有關。 本研究電針參數(shù)設置如下：疏密波，頻率10 Hz，強度以保持肢體輕微震顫為度，時間30 min。 疏密波可以更加快速地清除自由基，促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復；而頻率1～100 Hz 疏密波可以有效促進局部組織血液循環(huán)，改善神經(jīng)組織營養(yǎng)，提高新陳代謝，促進炎癥吸收。 這與張堯等［16-18］研究結果一致。此外，本研究采用電針針刺懸鐘穴、陽陵泉穴，這2個穴位均分布于足少陽膽經(jīng)，屬于八會穴，分別是筋與髓的精氣匯聚之處。 針刺這2 個穴位可以有效激發(fā)臟腑經(jīng)絡之氣，促進氣血流通，濡養(yǎng)經(jīng)脈，從而緩解肌肉痙攣，改善肢體運動功能障礙［19］。這與陳向華等［20］研究結果一致。

4 小 結

本研究證實電針陽陵泉穴、懸鐘穴干預SCII，對脊髓組織具有良好的保護作用，而這可能是通過介導免疫炎癥反應發(fā)揮作用，其具體作用機制可能是在特定時間點電針通過上調(diào)IL-1Rα 的表達，降低TNF-α、IL-1β 及IL-6 的水平，從而發(fā)揮對脊髓組織的免疫保護作用。 這可為臨床早期開始治療SCII 提供一定的理論依據(jù)。