生長抑素聯合吉西他濱對人胰腺癌BxPC-3細胞增殖抑制作用的研究*

劉 力 王文婷

湘南學院附屬醫院，湖南省郴州市 423000

胰腺癌患者死亡率高、預后差，全球范圍內5年生存率不足5%，而在我國僅為4%[1-3],究其原因主要與診斷困難及易侵襲轉移有關。大量文獻報道[4]胰腺癌的主要化療藥物“吉西他濱(Gem)”具有顯著耐藥性，亦被認為是預后差的原因。故如何提高吉西他濱化療效果被廣大學者重視。針對于此，發現多種藥物(姜黃素[5]、維拉帕米[6]、漢防己甲素[7]等)能有效降低吉西他濱的耐藥性，提高化療效果。生長抑素(SST)為臨床常用于治療胰腺疾病的藥物，被發現具有多種抗腫瘤作用，其中包括降低腫瘤對化療藥物的耐藥性。筆者前期實驗發現生長抑素可抑制胰腺導管狀乳頭癌細胞早期侵襲轉移和增強吉西他濱化療效果。為進一步明確生長抑素在胰腺原位癌細胞中是否同樣具有以上效應，本課題組進行了下述實驗。通過觀察生長抑素聯合吉西他濱對人原位胰腺癌細胞 BxPC-3進行干預，監測藥物對細胞增殖抑制的影響，尋找臨床治療原位胰腺癌更有效的化療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株BxPC-3購于中國科學院細胞庫，吉西他濱及生長抑素購于揚子江集團藥業有限公司，DMEM培養基、胰蛋白酶購于美國Sigma公司，噻唑藍(MTT)購于MP Biomedicals公司，胎牛血清購于美國Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:BxPC-3細胞在DMEM完全培養基中(包含體積分數10%胎牛血清、50μl/ml青霉素和100μl/ml鏈霉素雙抗)進行培養。將其置于體積分數5%CO2的培養箱中，設置為37℃，待細胞生長良好后，取對數生長期細胞，使用胰酶進行消化，用來配制為細胞懸液；調整細胞密度約為5×104細胞/ml，接種于96孔板中，每孔約5 000細胞數；同樣條件下培養24h后使細胞貼壁。取細胞進行下列實驗。分別得出吸光度值(OD值)后進行計算，公式：細胞增殖抑制率 = (1-實驗組OD值)/對照組OD值。記錄結果并制表。

1.2.2 MTT比色法檢測生長抑素對細胞增殖影響：(1)在細胞中加入0、100、200、400、600、800μg/ml的SST，分別加入5復孔(此為實驗組均為5復孔)，處理24、48、72h；(2)培養好后，吸去各孔內的反應液，使用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗2次，洗去剩余的殘留液，在5孔內分別加入20μl MTT(5mg/ml)溶液，加入相應培養液直至100μl，繼續在培養箱中培養4h；(3)在每孔內吸干MTT培養液，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，使用室溫搖床進行震蕩，震蕩時間5～10min，在波長約490nm處采用酶標儀檢測各孔的OD 值，通過公式計算各組細胞增殖抑制率；(4)由以上結果計算SST半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3 MTT比色法檢測吉西他濱對細胞增殖影響：(1)在細胞中加入0、0.1、1、5、10、20、40、60μmol/L Gem，按SST IC50的濃度時間，對細胞進行干預處理；(2)干預方法同1.2.2；(3)由以上結果計算出Gem IC50 濃度。

1.2.4 MTT比色法檢測聯合用藥對細胞增殖影響：(1)根據以上實驗得出SST、Gem IC50濃度，使用該濃度藥物處理，并進行分組：A組:空白對照組，B組：SST IC50，C組：Gem IC50，D組：1/2(SST IC50+Gem IC50)，按SST IC50的時間進行處理。(2)干預方法同1.2.2，計算各組細胞增殖抑制率。計算兩藥相互作用：q=D組抑制率/B及C組抑制率之和-B及C組抑制率之積。當q值<0.85時，表示SST、Gem具有拮抗作用；當0.85≤q值≤1.15，表示SST、Gem具有相加作用；當q值>1.15時，表示SST、Gem具有協同作用。

2 結果

2.1 各濃度SST對BxPC-3細胞的增殖抑制作用 MTT實驗觀察SST在不同濃度(0、100、200、400、600、800μg/ml)及不同作用時間(24、48、72h)的情況下，對BxPC-3細胞的抑制效率。SST干預24h后，僅800μg/ml濃度的生長抑素對BxPC-3有抑制作用(P<0.05)；處理48h后，藥物濃度為600～800μg/ml處理組較陰性對照組的BxPC-3細胞增殖受到明顯抑制(P<0.05)，但是二組組間差異無統計學意義(P>0.05)；處理72h后，濃度為400～800μg/ml處理組細胞增殖抑制率增加，800μg/ml處理組較600μg/ml處理組顯著增加，具有統計學意義(P<0.05)。經ANOVA分析，得出F值為9.279(P<0.01)，表明隨時間的增加其抑制率亦增加，差異具有統計學意義(P<0.01)。當濃度為600μg/ml的SST，在處理72h后，達到半數抑制(SST IC50)。見表1。

表1 SST對BxPC-3細胞增殖抑制

2.2 各濃度Gem對BxPC-3細胞的增殖抑制作用 依據上述實驗結果選取Gem干預時間為72h。MTT 實驗觀察Gem在不同濃度(0、0.1、1、5、10、20、40、60μmol/L)對BxPC-3細胞的抑制效率。結果顯示：各濃度Gem對BxPC-3細胞均具有抑制作用(P<0.05)，并且隨著藥物濃度增加其抑制率增加，呈正相關。當藥物濃度為60μmol/L時，BxPC-3細胞增殖抑制率達90%以上。在濃度為20μmol/L Gem干預時達到半數抑制。見表2。

2.3 兩藥聯合對BxPC-3細胞的增殖抑制作用 MTT實驗觀察600μg/ml SST(B組),20μmol/L Gem(C組)及兩藥聯合(SST 300μg/ml+Gem 10μmol/L)(D組)對BxPC-3細胞的抑制效率。結果顯示：B、C組均能抑制BxPC-3細胞的增殖，但D組抑制率明顯大于B、C組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。經公式計算兩藥相互作用q=0.887，提示聯合用藥具有相加作用。

表2 Gem對BxPC-3O細胞增殖抑制作用

表3 SST和Gem聯合作用對BxPC-3細胞增殖抑制作用

3 討論

胰腺癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，全球5年生存率低于5%。據國家癌癥中心的統計，中國每年新增約1.3%的胰腺癌患者，2015年，胰腺癌的發病概率一路攀升到惡性腫瘤排行的第九位，死亡率排名第六[8]。全球胰腺癌的發病率和死亡率也在迅速增長[9]。預計到2030年，胰腺癌極有可能化身成為美國第二大致命癌癥。隨著醫學生物技術的發展，各種新的癌癥治療方案，如靶向治療、生物治療等紛紛出現[10]，然而，由于胰腺癌的復雜解剖學和病理學特征，治療效果差強人意。其預后如此差的主要原因[11-12]：(1)早期癥狀不明顯，有效診斷難度大；(2)腫瘤存在早期侵襲和轉移發生的可能，多數患者無法進行根治性外科手術；(3)對一線化療藥物“吉西他濱”存在顯著耐藥性。

生長抑素臨床常用于治療急性胰腺炎、胰腺手術后、胃泌素瘤、胰島素瘤等疾病，并有大量報道發現生長抑素具有多種抗腫瘤作用[13-15]，包括誘導癌細胞凋亡、阻斷癌細胞增殖周期、抑制腫瘤血管生成、抑制癌細胞侵襲等。高元平等[16]綜合報道了生長抑素的抗腫瘤作用，其中提到生長抑素能降低腫瘤對化療藥物的耐藥性，包括垂體腫瘤、肺癌、膽囊癌等。針對于此，筆者設想生長抑素在胰腺癌化療中有同樣效果，降低吉西他濱耐藥性，有效提高化療效果。故開展了本系列實驗。通過前期研究，發現生長抑素可抑制人胰腺導管乳頭狀癌PANC-1和人轉移性胰腺癌AsPC-1細胞的增殖，并且能有效增強吉西他濱對人胰腺導管乳頭狀癌PANC-1的化療效果。而因胰腺癌早期原位癌病理類型在臨床上也很常見，為了進一步闡明生長抑素是否對原位胰腺癌細胞具有相同的作用，本研究小組繼續進行了這項實驗。BxPC-3細胞株源自原位胰腺癌細胞，故本實驗采用胰腺癌BxPC-3細胞作為模式細胞。

在MTT實驗中，干預24h后，僅800μg/ml處理組有抑制作用(P<0.05)。在48h后600～800μg/ml處理組具有抑制作用(P<0.05)，但是二組組間差異無統計學意義(P>0.05)。而在72h后，濃度為400～800μg/ml處理組均具有抑制作用，且800μg/ml處理組較600μg/ml處理組顯著增加，具有統計學意義(P<0.05)。說明生長抑素需在一定濃度及作用時間方能對BxPC-3細胞起到顯著抑制作用。而作為胰腺癌主要化療藥物吉西他濱，它的抑制作用顯著存在。實驗結果可知各濃度吉西他濱對BxPC-3細胞均具有抑制作用(P<0.05)，并且抑制率與藥物濃度呈正相關。依據以上結果計算出生長抑素和吉西他濱半數抑制濃度，用此濃度聯合進行干預。結果發現：兩者聯合用藥組抑制率明顯大于單藥組，差異具有統計學意義。通過計算兩藥相互作用率q=0.887,表面聯合用藥具有相加作用，能有效地提高吉西他濱化療效果，但能否應用于臨床尚需在后續臨床試驗中進行驗證。