雌激素受體基因多態性與魯南地區漢族婦女卵巢反應性的相關性研究*

邱 欣 王 偉 吳秋紅 薛子成 李 雨 劉衛東

山東省棗莊市婦幼保健院藥學部 277000

目前通過相關生殖助孕技術出生的新生兒占2%～3%[1-2]。在輔助生殖技術中，目前使用最多的是體外受精—胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)技術。該技術治療過程的第一步即為控制性超促排卵(Controlled ovarian hyperstimulation，COH)。卵巢對外源性促性腺激素的反應能力是IVF-ET成功的關鍵影響要素之一[3]。但不孕癥患者對外源性促性腺激素的反應存在個體差異性，同時引起卵巢反應性差異的真正機制尚未闡明，目前認為主要與患者年齡、卵巢儲備、卵巢局部的旁/自分泌活動及遺傳等因素相關。

雌激素(Estrogen，E)是一種通過與雌激素受體(Estrogen receptor，ER)結合而發揮作用的類固醇類激素[4]。目前研究發現ER有兩種亞型，即ERα和ERβ，分別由ER1和ER2基因編碼。由于其存在遺傳多態性，可能影響ERα和 ERβ的表達和相關功能，其次不同個體間COH的臨床結局也有很大差異，這將導致卵巢反應過低或嚴重的卵巢過度刺激征的發生[5-6]。因此，本文初步探討了雌激素受體基因多態性與魯南地區漢族婦女卵巢反應性的相關性，以期為不孕癥患者的臨床個體化給藥提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 入選研究對象為2018年1月—2019年12月在棗莊市婦幼保健院生殖醫學中心行IVF-ET技術或卵母細胞顯微單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI) 的100例不孕患者。本研究經山東省棗莊市婦幼保健院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。納入標準：(1) 年齡20～40歲；(2) BMI：18～30； (3) 月經周期正常；(4) 基礎卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)值在5～12IU/L之間；(5) 因女方輸卵管因素或男方因素行IVF治療；(6) 第一次接受COH治療； (7) 染色體核型正常。排除標準：(1)卵巢或相鄰臟器手術史者；(2)其他婦科、內分泌及代謝異常疾病者；(3)異?；A竇卵泡數；(4)其他臨床醫師或研究人員認為不適合納入的對象。

1.2 控制性超促排卵方案與取卵 所有患者均使用促性腺激素釋放激素拮抗劑(Gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRH-A)。于月經第3天根據基礎患者FSH、基礎竇卵泡數(Antral follicle count，AFC)與BMI等指標采用重組卵泡刺激素75～200IU啟動促排卵。當主卵泡群卵泡直徑>12mm時，給予GnRH拮抗劑。當主導卵泡群中至少2個優勢卵泡直徑>18mm，并參考患者雌激素水平，在合適時單次注射人絨毛促性腺激素500～10 000單位誘導排卵，并于36h后行經陰超聲引導下取卵術。

1.3 儀器與試劑 熒光檢測儀(TL 998A，西安天隆科技有限公司)；渦旋混合儀(XW-3，上海滬西分析儀器廠有限公司)；低溫離心機(Centrifuge 5430R，德國eppendorf)；熒光染色原位雜交及染色體核型分析系統(北京華夏時代基因科技發展有限公司)。

GnRH拮抗劑(GnRH-A，ORGALUTRAN：N．V．Organon)；人絨毛促性腺激素(中國麗珠制藥)；氯化銨溶液、核酸純化試劑(北京華夏時代基因科技發展有限公司，貨號：20190211)，測序反應試劑盒(北京華夏時代基因科技發展有限公司，貨號：20190815)。

1.4 方法

1.4.1 樣本收集和分組:所有入組患者取外周靜脈血2～3ml置于EDTA抗凝管中。根據COH 的情況將患者分為三組：(1)卵巢高反應組(高反應組)：獲卵數≥15個。(2)卵巢低反應組(低反應組)：當COH 過程中出現以下情況之一即納入本組：獲卵數≤5個，HCG 注射日E2<500ng/L，平均每日Gn劑量≥300IU，總Gn用量≥44支(75IU/支)，Gn刺激時間≥15d。(3)正常反應組(正常組)：獲卵數6～14個，此組作為對照組。

1.4.2 樣本前處理:精密量取滅菌注射用水900μl至1.5ml離心管中，加入100μl預處理液和200μl全血樣本，渦旋混合后置10min離心(轉速3 500r/min，5min)，棄上清液。在富集的白細胞沉淀中加入核酸純化試劑 50μl，反復吹打混勻后室溫靜置 20～40min，得到白細胞混懸液。精密吸取白細胞混懸液2.0μl加入至測序反應試劑中充分混勻，采用熒光原位雜交技術進行檢測，采用染色體核型分析系統直接讀取基因分型結果。

1.4.3 基因型測定:按“1.4.2”項下方法提取100例不孕癥患者的白細胞混懸液，吸取2.0μl分別加入至ER基因位點測序反應試劑中，充分混勻，采用熒光原位雜交技術進行檢測，并使用染色體核型分析系統直接讀取基因分型結果。

2 結果

2.1 一般資料和Hardy-Weinberg平衡 本試驗共納入100例不孕患者，其一般資料(年齡、體質量、BMI和FSH值)見表1。

表1 三組患者的基本資料比較

2.2 ERα基因型和等位基因頻率比較 高反應組和低反應組患者ERα基因位點PvuⅡ (rs2234693)基因型頻率與等位基因頻率與正常組之間的差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表2。高反應組患者ERα基因位點Xba Ⅰ(rs9340799)等位基因頻率與正常組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。然而，低反應組患者ERα基因位點XbaⅠ(rs9340799)等位基因頻率與正常組之間的差異具有統計學意義(P<0.05)，結果見表2。

表2 ERα基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

2.3 ERβ基因型和等位基因頻率比較 高反應組和低反應組患者ERβ基因位點RsaⅠ(rs1256049)基因型頻率和等位基因頻率與正常組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。高反應組和低反應組患者ERβ基因位點AluⅠ(rs4986938)基因型頻率和等位基因頻率與正常組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 ERβ基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

3 討論

隨著人民生活水平的日益提高，不孕癥的發生率也隨之逐漸增高，因此越來越多的患者接受輔助生殖助孕技術進行治療[7]。隨著接受COH治療患者的增加，卵巢過度刺激綜合征(Ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的發生率逐年增加。

相關國內外文獻發現ER基因在卵巢反應中起著重要作用[8-11]，ER基因突變與COH結局密切相關[4,12]。許多婦科及內分泌疾病如不孕癥、復發性流產、子宮肌瘤、子宮內膜癌以及子宮內膜異位癥的發生都可能與ER基因多態性相關[13]。ER有ERα和ERβ兩個亞型，分別由ER1和ER2基因編碼。ER基因具有高度的基因多態性，目前已發現ER1基因有2 800多個SNP位點，ER2基因有720多個SNP位點。其中位于ERl基因內含子l上的PvuⅡ T/C(rs2234693)、XbaⅠ A/G(rs9340799)，位于ER2基因的AluⅠ G/A(rs4986938)位點與COH治療反應性的相關性已被國內外大量研究者進行了探索。Sundarrajan等[12]發現使用IVF治療的200例新加坡華裔不孕患者與正常人群相比，卵泡數、成熟卵泡數和妊娠率在PvuⅡ CC、TC、TT基因型3組間均存在顯著性差異。Georgiou等[4]發現，希臘人群中的ER1基因PvuⅡ T/C位點與COH或IVF患者的妊娠結局顯著相關。Altmae等[5]研究也發現，ERl基因PvuⅡ T/C的CC和XbaⅠ A/G的GG基因型對COH治療有較好的反應，并增加IVF的成功率。

而本研究結果顯示：低反應組患者ERα基因位點XbaⅠ(rs9340799)等位基因頻率與正常組之間的差異具有統計學意義(P<0.01)。因此，ERα基因位點XbaⅠ(rs9340799)基因多態性與魯南地區漢族婦女COH中的卵巢低反應相關，G等位基因可增加卵巢低反應的風險。

ER基因在不同地域和種族間的分布存在的差異性也導致了研究結論的不一致[4,12-14]。因此，ER基因多態性與不孕癥婦女卵巢反應性的相關性研究仍需要擴大樣本量，并在不同地域和種族間進行進一步的研究和探討。

隨著人類從基因水平對許多疾病進行深入的探究，基因組學研究正在不斷發展進步，可能在不久的將來會有更多疾病的易感性被證實與其相關基因多態性有關，并進行了多地區、多種族和大樣本的系統研究，從而疾病的預防和治療也將進入新的領域。