Protectin DX對老年大鼠肺損傷相關炎性因子和氧化損傷的保護作用

魏敬軍 魏崇莉 張永霞 戴沛軍

(1.聯勤保障部隊第九四〇醫院檢驗科,蘭州 730070)(2.聯勤保障部隊第九四〇醫院預防控制科,蘭州 730070)(3.聯勤保障部隊第九四〇醫院呼吸內科,蘭州730070)

胸科手術中肺損傷發生率較高,其中肺葉切除術是引起肺損傷的常見胸科手術之一,肺葉切除手術會導致氧自由基及炎性因子的產生和釋放,甚至會引起相關肺損傷的發生[1]。迄今為止有關肺葉切除術后的肺損傷的機制尚未被完全闡明,且暫無確切有效的治療措施。近幾年有研究發現抑制肺葉切除術過程中氧化應激和炎癥反應,可以明顯降低肺損傷的發生和發展,進而改善患者預后[2-3]。Protectins是一種具有明顯抑制炎癥反應作用的特異性促炎癥消退介質[4]。Protectin DX(PDX)是 Protectins的重要成員[5],研究表明,PDX可以明顯減輕氧化應激反應[6],抑制促炎癥因子及中性粒細胞的聚集,促進巨噬細胞功能[7-8]。而肺葉切除術多應用于局部肺葉內的不可逆性病變,考慮到臨床實踐中接受肺葉切除手術的患者多為老年人,本研究將選用老年大鼠構建肺葉切除術后肺損傷模型,用PDX進行干預治療,初步探討PDX對老年大鼠肺葉切除術后肺損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

30只SPF級健康老年雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2017-0007,10月齡,體質量為360～420 g。飼養于SPF級環境中,12 h/12 h明暗交替,溫度為22～25℃,相對濕度為45%～60%,自由進食和飲水,適應性喂養1周后進行實驗,本實驗通過本院動物倫理委員會審批。

1.2 主要儀器及試劑

低溫冷凍離心機3K15(美國 Sigma公司),Varioskan LUX多功能酶標儀(美國Thermo公司);PDX(美國 Cayman公司),大鼠 IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),OH-1、NF-κB等抗體(美國 CST公司),山羊抗兔二抗(武漢安特捷生物技術有限公司),細胞總蛋白及核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)、BCA蛋白定量試劑盒(美國 Thermo公司)、MDA、SOD、ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所)等。

1.3 大鼠肺損傷模型制備及分組

30只SD老年大鼠按照隨機數字表分為假手術組、手術組和PDX處理組,每組10只。所有大鼠于實驗前禁食12 h后腹腔注射50 mg/kg體質量戊巴比妥鈉,待麻醉成功后將其仰臥位固定于手術臺上,并于右側第 4～5肋間備皮,開胸。手術組和 PDX處理組大鼠去除第4～5肋部分肋骨,暴露右側肺,分離結扎血管及支氣管后行右下肺葉切除術;假手術組除不進行右下肺葉切除術外,其余操作同手術組及PDX處理組。所有大鼠術后進行右胸腔閉式引流。術后待大鼠蘇醒后,放回籠中繼續飼養。于造模1 h后假手術組和手術組大鼠腹腔注射300μL生理鹽水,PDX處理組腹腔注射300μL PDX(500 ng)。24 h后采用過度麻醉法處死大鼠,收集各組大鼠肺組織及肺泡灌洗液,備用。

1.4 肺組織病理損傷評分標準

收集各組大鼠的右肺上葉,使用4%多聚甲醛將肺組織固定24 h后進行脫水,透明處理,石蠟包埋,常規切片(5μm),將切片脫蠟后行蘇木精-伊紅(HE)染色,使用普通光學顯微鏡觀察肺組織損傷情況。參照美國胸科學會公布的肺組織損傷評分標準[9]對肺損傷程度進行評定。

1.5 肺組織干濕質量比(W/D)

收集并稱量各組大鼠新鮮的右肺中葉組織質量,然后將肺組織放入恒溫烤箱中,烘干至恒重后再次稱重并記錄。兩次肺組織的質量之比即為肺組織的W/D。

1.6 肺泡灌洗液中蛋白濃度檢測

結扎大鼠右肺后,使用生理鹽水灌洗左肺,每次1 mL,共3次。采集各組大鼠的肺泡灌洗液,每組設3個復孔,按照 BCA試劑盒說明書(BCA Protein Assay Kit)檢測肺泡灌洗液中的蛋白濃度。

1.7 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測肺泡灌洗液中相關炎性因子水平

取各組大鼠肺泡灌洗液適量,每組設3個復孔,按照ELISA試劑盒說明書檢測肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和 TNF-α 水平。

1.8 3組大鼠肺組織中氧化應激水平的檢測

取各組大鼠肺組織勻漿,每組設3個復孔,參照SOD、MDA、ROS試劑盒說明書對各組肺組織中SOD活性、MDA及ROS含量進行檢測。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測肺組織中HO-1、核轉錄因子-κB(NF-κB)蛋白水平

取貯存于-80℃冰箱中的各組大鼠肺組織適量,采用RIPA試劑盒及核蛋白提取試劑盒提取肺組織總蛋白及核蛋白,采用BCA試劑盒檢測各組樣本的蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳,每個泳道加40μg總蛋白。濕法轉膜將蛋白轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。隨后將膜分別置于含HO-1(1 ∶1000)、NF-κB(1 ∶1000)、核內參 Lamin B(1∶1000)及肺組織蛋白內參GAPDH(1 ∶1000)的一抗稀釋液中于4℃下孵育過夜。次日回收一抗,用TBST漂洗3次,10 m in/次,隨后將膜置于用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)稀釋液中室溫下孵育1.5 h,隨后用 TBST洗膜,采用超敏 ECL化學發光試劑盒進行顯影曝光。以Lamin B作為NF-κB的參照、GAPDH作為 HO-1蛋白的參照,應用Image J對目的蛋白條帶進行灰度值分析。

1.10 統計方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理,計量資料結果使用均數±標準差(±s)表示,組間采用單因素方差分析比較,計數資料采用卡方檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠肺組織病理形態分析

假手術組老年大鼠肺組織肺泡壁結構完整,肺泡間隔無增厚且無炎性細胞浸潤;與假手術組相比較,手術組老年大鼠肺組織結構明顯受損,肺泡間隔明顯增厚且可見大量肺泡融合,肺泡間隔及肺泡腔內發現大量炎癥細胞浸潤等,而PDX處理組損傷程度明顯減輕,肺泡間隔及肺泡腔內發現少量炎癥細胞浸潤。肺組織病理評分與鏡下觀察結果一致(P＜0.01),見表1、圖1。

表1 各組老年大鼠肺組織損傷評分(±s,分)Table 1 Lung tissue in jury scores of aged rats in each group (±s,points)

表1 各組老年大鼠肺組織損傷評分(±s,分)Table 1 Lung tissue in jury scores of aged rats in each group (±s,points)

注:與假手術組相比,??P＜0.01;與手術組比較,##P＜0.01Note:Compared with sham group,??P＜0.01;Compared with surgery group,##P＜0.01

組別肺損傷評分 F P假手術組0.287±0.142 5.217 /手術組0.594±0.203?? 6.032 0.006 PDX 處理組 0.376±0.217## 5.469 0.009

圖1 各組肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissue in each group (×200)

2.2 3組的肺組織W/D和肺泡灌洗液中蛋白濃度對比結果

由實驗結果可知:與假手術組相比,手術組大鼠肺組織W/D比值和肺泡灌洗液中的蛋白濃度明顯增加(P＜0.01);與手術組相比較,PDX處理組大鼠的W/D比值和肺泡灌洗液中的蛋白濃度明顯下降(P＜0.01),見表 2。

表2 3組大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中的蛋白濃度分析Table 2W/D ratio of three groups of rats and analysis of protein concentration in alveolar lavage fluid

2.3 3組大鼠肺泡灌洗液中相關炎癥因子分析

采用酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠肺泡灌洗液中 IL-1β及TNF-α、IL-6水平。由實驗結果可知:手術組大鼠肺部的 IL-1β、TNF-α、IL-6水平高于假手術組(P＜0.05,P＜0.01);與手術組相比,PDX處理組的IL-1β、TNF-α、IL-6水平明顯下降(P＜0.05,P＜0.01),見表 3。

2.4 3組大鼠肺組織中氧化應激評價

由實驗結果可知:與假手術組相比較,手術組老年大鼠肺組織中MDA和ROS含量顯著升高(P＜0.05),而SOD活性明顯降低(P＜0.05);與手術組老年大鼠相比較,PDX處理組老年大鼠肺組織中MDA和ROS含量顯著減少(P＜0.05),而 SOD 活性明顯上調(P＜0.05),見表4。

表3 各組大鼠的肺組織灌洗液中的IL-1β、TNF-α及IL-6 水平分析(±s,pg/mL)Table 3 Analysis of IL-1β,TNF-αand IL-6 levels in lung tissue lavage fluid of each group of rats(±s,pg/mL)

表3 各組大鼠的肺組織灌洗液中的IL-1β、TNF-α及IL-6 水平分析(±s,pg/mL)Table 3 Analysis of IL-1β,TNF-αand IL-6 levels in lung tissue lavage fluid of each group of rats(±s,pg/mL)

注:與假手術組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與手術組比較,##P＜0.05Note:Compared with sham group,?P＜0.05,??P＜0.01;Compared with surgery group,##P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α IL-6假手術組 16.847±3.204 30.183±5.270 176.014±8.270手術組 39.876±4.093? 248.064±5.864?? 790.207±9.478??PDX 處理組 27.564±3.814##129.857±6.028## 518.706±8.912##F 13.901 19.328 23.762 P 0.023 0.000 0.000

表4 各組老年大鼠的肺組織中M DA、ROS 及 SOD 表達水平(±s)Table 4 MDA,ROS and SOD expression levels in lung tissue of aged rats in each group(±s)

表4 各組老年大鼠的肺組織中M DA、ROS 及 SOD 表達水平(±s)Table 4 MDA,ROS and SOD expression levels in lung tissue of aged rats in each group(±s)

注:與假手術組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與手術組比較,#P＜0.05,##P＜0.01Note:Compared with sham grou,?P ＜ 0.05,??P ＜ 0.01;Compared with surgery,#P＜0.05,##P＜0.01

組別 MDA/(μmol/L) ROS(U/mL) SOD/(U/mg)假手術組 127.017±5.174 1.043±0.701 41.025±4.207手術組 192.864±4.894? 4.870±0.945?? 16.461±1.608?PDX 處理組 151.207±6.045# 2.516±0.728## 27.504±2.862##F 15.119 2.840 7.224 P 0.037 0.000 0.013

2.5 3組老年大鼠肺組織中HO-1、NF-κB蛋白的表達情況

由Western blot檢測結果可知:與假手術組相比較,手術組大鼠肺組織中NF-κB蛋白的表達水平顯著上調(P＜0.05),HO-1蛋白的相對表達水平明顯下調(P＜0.05);與手術組相比較,PDX處理組大鼠肺組織中 NF-κB蛋白的表達水平明顯降低(P＜0.05),HO-1蛋白的相對表達水平顯著提高(P＜0.05),見表5、圖2。

表5 各組大鼠的肺組織中HO-1及NF-κB蛋白的相對表達水平Table 5 Relative exp ression levels of HO-1 and NF-κB protein in lung tissue of rats in each group

圖2 各組大鼠的肺組織中HO-1及NF-κB蛋白的相對表達水平Fig.2 Relative expression levels of HO-1 and NF-κB protein in lung tissue of rats in each group

3 討論

迄今為止,有關肺葉切除術后肺損傷發生的確切機制尚未被完全闡明,但有大量研究表明肺葉切除手術后氧化應激損傷和炎性因子的大量產生是導致肺損傷主要因素。PDX作為特異性促炎癥消退介質,具有強大的抗氧化應激反應和抑制相關炎癥因子釋放的作用[10-12],但目前尚無有關報道分析PDX對老年大鼠肺葉切除術后肺損傷的保護作用。

本研究通過肺葉切除術構建老年大鼠肺損傷模型來初步探索PDX對老年大鼠肺葉切除術后肺損傷的保護作用,評估肺葉切除術后肺組織的損傷程度,衡量肺組織微血管的通透性和肺組織的水腫程度。實驗結果表明,老年大鼠肺葉切除術后存在明顯肺損傷現象,而PDX的干預可改善肺損傷的程度,提示PDX對老年大鼠肺葉切除術后肺損傷具有一定的治療作用。

過度的炎癥反應是老年大鼠肺葉切除術后肺損傷發生的重要原因之一,本實驗結果表明,肺葉切除術可以使肺組織中的 IL-6、TNF-α、IL-1β均明顯升高,提示大鼠肺葉切除術后會產生過度的炎癥反應,表現為大量的促炎癥因子釋放,從而加重肺損傷。PDX的干預可以明顯抑制相關炎性因子的釋放,減輕肺損傷。有研究表明,肺葉切除術后肺組織會發生明顯的氧化應激反應,表現為氧化因子和抗氧化因子水平的異常,過度的氧化應激反應是導致肺損傷的主要誘因之一[13]。本研究結果發現,與假手術組相比較,手術組老年大鼠肺組織中SOD活性降低,ROS和 MDA含量升高(P＜0.05),當給予 PDX干預后SOD活性升高,ROS和MDA含量降低,提示PDX可以通過抑制肺組織氧化應激損傷來減輕肺組織損傷。

在機體處于正常的生理條件下,IκBα與 NF-κB的p65亞單位結合形成復合物[14]以無活性的結合型存在于細胞質內。當受到細胞因子、活性氧等刺激后,IκBα發生降解,NF-κB被激活且隨之轉移到細胞核中,促進基因轉錄,從而調節炎癥信使參與炎癥反應[15]。研究發現氧化應激是促進NF-κB 活化的重要因素[16-17],而HO-1是人體內血紅素代謝途徑中的限速酶,其間接代謝產物具有強大的抗氧化功能[18]。HO-1作為一種保護性蛋白,其抗氧化、抗炎等多種功能已經得到證實[19-20],HO-1對急性肺損傷的炎癥反應和氧化應激反應也具有負調節作用[21]。

因此推測PDX對老年大鼠肺葉切除術后肺損傷的保護作用可能與 NF-κB和 HO-1的表達有關。本研究結果表明,肺葉切除術后老年大鼠肺組織中HO-1蛋白的表達較假手術組顯著降低(P＜0.05),NF-κB蛋白的表達明顯增加,PDX的干預可促進HO-1的表達,同時抑制 NF-κB的表達。這提示PDX的干預可抑制機體的氧化應激反應和炎癥反應,且這種作用可能與促進HO-1的表達和抑制NF-κB的表達密切相關。

綜上所述,老年大鼠肺葉切除術后的肺損傷與機體氧化應激和炎癥反應密切相關,且PDX可以通過促進HO-1表達和抑制NF-κB表達減輕老年大鼠肺葉切除術后的氧化應激反應和炎癥反應。