化滯柔肝顆粒治療高脂非酒精性脂肪肝炎模型鼠的療效觀察

史會連 方南元 陳沁磊

摘要 目的：觀察化滯柔肝顆粒對高脂誘導的非酒精性脂肪性肝炎小鼠的保護作用及初步機制。方法：將小鼠隨機分成正常組、安慰劑組、低、高劑量化滯柔肝組和易善復組，通過高脂飲食喂養8周，經HE染色確定建立了非酒精性脂肪肝肝炎小鼠模型，后各組給予不同藥物灌胃，正常組及安慰劑組予以生理鹽水灌胃，治療持續4周。在末次給藥后，解剖動物，取血清和肝組織，進行相應的檢查。結果：在治療4周末，HE染色及油紅顯示模型組肝組織細胞腫脹，脂肪沉積，其體質量、血清ALT、TG水平分別為（41.2±1.7）g、（81.07±3.19）U/L和（2.69±1.30）mmol/L，均顯著高于正常組的體質量、血清ALT、TG水平（21.31±1.42）g、（31.2±2.74）U/L和（0.48±0.14）mmol/L（P<0.05），結果顯示模型成功建立;后續HE染色、油紅染色顯示高劑量化滯柔肝組改善肝臟炎性反應及脂質沉積的作用較安慰劑組、低劑量化滯柔肝顆粒組、易善復組更加明顯，且后續血清ALT及TG水平結果也和上述結果一致（P<0.05），但各觀察組之間AST水平均無明顯變化;通過對血清中細胞因子IL-18和IL-1β的檢測，結果顯示化滯柔肝顆粒組可降低細胞因子IL-18和IL-1β的水平，降低細胞因子的水平且較安慰劑組、易善復組更為明顯，且呈劑量依耐性（P<0.05）。結論：化滯柔肝顆粒對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝肝炎小鼠有保護作用，且和細胞因子IL-18和IL-1β有一定的相關性。

關鍵詞 化滯柔肝顆粒;非酒精性脂肪肝肝炎;白細胞介素-1β;白細胞介素-18

Abstract Objective：To observe the protective effect of Modified Huazhi Rougan Granule on mice model with nonalcoholic steatohepatitis induced by high fat diet and explore its preliminary mechanism.Methods：The mice were randomly divided into normal group，placebo group，low and high dose of Huazhi Rougan Granule group and YiShanFu group.The mice were fed with high-fat diet for 8 weeks，then these mice were confirmed by HE staining to establish the model of nonalcoholic steatohepatitis.After that，each group was given different drugs by gavage for 4 weeks.At the same time，the normal group and placebo group were given normal saline by gavage for 4 weeks.After the last administration，the animals were dissected，serum and liver tissues were taken for corresponding examination.Results：At the end of the 4th week of treatment，HE and oil red staining showed that liver cells were swollen and filled by fat deposition in the model group，and the body weight，serum ALT and TG levels were（41.2±1.7）g，（81.07±3.19）U/L and（2.69±1.30）mmol/L respectively，which were significantly higher than those in the normal group（21.31±1.42）g，（31.2±2.74）U/L and（0.48±0.14）mmol/L（P<0.05）; following HE and oil red staining showed that the effect of high dose of Huazhi Rougan Granule group on improving liver inflammation and lipid deposition was more obvious than that of placebo group，low dose of Huazhi Rougan Granule group and Yishanfu group，and the follow-up serum ALT and TG levels were consistent with the above results（P<0.05）.However，there was no significant change in AST level among the experimental groups; through the detection of cytokines IL-18 and IL-1 β in serum，the results showed that the Huazhi Rougan Granule group could reduce the levels of cytokines IL-18 and IL-1 β，and reduce the level of cytokines，which was more remarkable than other groups（P<0.05）.Conclusion：Huazhi Rougan Granule has protective effect on mice model with nonalcoholic steatohepatitis induced by high-fat diet，and it has certain correlation with IL-18 and IL-1 β.

Keywords Huazhi Rougan Granule; Nonalcoholic steatohepatitis; IL-1 β; IL-18

中圖分類號：R453.9 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.006

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatry Fiver Disease，NAFLD）是一種無過量酒精攝入，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。NAFLD成人發病率為6.3% ～45%，其中10% ～30%為非酒精性脂肪肝炎（Non-alcoholic Steatohepatitis，NASH）[1-2]，當NAFLD由簡單的脂肪變性向NASH轉化時，肝臟更易向纖維化，肝臟衰竭和肝細胞癌等進展[3]，嚴重危害人們的健康。因此，NASH的防治顯得尤為重要，但目前NASH的具體機制尚不清楚，治療上西醫藥物療效不確切，且容易反彈，在臨床工作及前期研究基礎中，我們發現中醫中藥在治療NASH方面更有優勢?；瘻岣晤w粒由茵陳、決明子、柴胡、山楂、大黃、澤瀉、白術、蒼術、陳皮等組成，具有清熱利濕、化濁解毒、祛瘀柔肝而不傷血的作用，臨床用于治療濕熱瘀積型非酒精性脂肪肝[4]，但目前機制尚不清楚，我們研究了該藥在高脂模型NASH鼠中的作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 所有的動物研究都得到了南京中醫藥大學動物倫理委員會的批準，本研究采用8至10周齡雄性C57BL/6J野生型小鼠，購買于上海南模生物有限公司（許可證號：QDZ-SHL&CYY），小鼠同室分籠飼養，照明12 h/d，每日補充1次料塊和水，環境溫度控制在18～22 ℃，濕度60%。

1.1.2 藥物 化滯柔肝顆粒（茵陳、決明子、大黃、澤瀉、豬苓、山楂、蒼術、白術、甘草等）（山東新時代藥業有限公司，生產批號：C14000073788）;多烯磷脂酰膽堿（易善復）[賽諾菲（北京）制藥有限公司，生產批號：B122010049590]。

1.1.3 試劑與儀器 IL-1β試劑盒（Abcam公司，英國，批號：ab197742）和IL-18試劑盒（Abcam公司，英國，批號：ab216165）;ALT試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-BC-K235-S）和TG試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-BC-K261-M）;全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特有限公司，美國，型號：AU5800）;組織包埋機（徠卡，德國，型號：Arcadia型）;石蠟切片機（徠卡，德國，RM2235）;熒光顯微鏡（徠卡，德國，型號：DM2000LED型）;生物顯微鏡（徠卡，德國，型號：DMI1）;通用臺式離心機（艾本德，德國，型號：艾本德5810R型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將動物分為野生鼠組+普通飲食組（空白組，A組），野生鼠組+高脂飲食組（安慰劑組，B組），野生鼠+高脂飲食+化滯柔肝顆粒低劑量處理組（低劑量組，C組），野生鼠+高脂飲食+化滯柔肝顆粒高劑量處理組（高劑量組，D組）和多烯磷脂酰膽堿組（易善復組，E組），每組動物8只。將動物置于（23±2）℃的清潔動物設施內，并控制每12 h光/暗循環。定期給小鼠喂食普通飼料/高脂飼料飲食，并予以動物飲用滅菌水。各組小鼠予以高脂飲食組/普通飲食喂養8周，高脂飲食由60%的脂肪，1.25%的膽固醇，0.5%w/w膽酸鹽組成（HFD飲食）[5]。

1.2.2 給藥方法 高脂飲食8周經病理證實形成NASH模型后，除去空白組外，其他各組繼續予以高脂飲食，接著A和B組予以生理鹽水灌胃做對照，根據體質量公式，C組予以低劑量化滯柔肝顆粒[3.6 g/（kg·d）]灌胃，D組予以高劑量化滯柔肝顆粒[14.4 g/（kg·d）]灌胃，E組予以多烯磷脂酰膽堿[150 mg/（kg·d）]灌胃4周。

1.3 觀測指標與方法 治療前后均予以小鼠稱重，治療療程結束后殺鼠，用3%多聚甲醛固定肝組織，常規石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。取血檢測谷丙轉氨酶（ALT），谷草轉氨酶（AST），三酰甘油（TG）的表達情況，同時通過酶聯免疫吸附試驗法對動物血清IL-18及IL-1β細胞因子進行檢測。

1.3.1 油紅染色分析 用4%多聚甲醛將7 μm厚冷凍肝切片固定10 min，用雙蒸水沖洗3次，取油紅O母液與雙蒸水以3∶ 2配制成油紅O工作液，并過濾2次，切片用60%異丙醇清洗后，用過濾好的油紅O工作液浸染10 min，用雙蒸水清洗，再用蘇木精染液復染30 s，自來水反藍，甘油明膠密封，最后用光學顯微鏡拍照并分析。

1.3.2 血清生化及IL-18和IL-1β標測 取靜脈血2 mL，使用BS-200型全自動生化分析儀測定血清中谷丙轉氨酶（ALT），谷草轉氨酶（AST），三酰甘油（TG），膽固醇（TC）水平的變化。酶聯免疫吸附試驗根據ELISA試劑盒（eBioscience，San Diego，CA，US）的指示定量血清中IL-1β和IL-18的水平。獲得血清，采用IL-1β、IL-18 Elisa試劑盒，嚴格參照說明書操作，反應終止后，酶標儀測定450 nm處的吸光度值（OD值），根據試劑盒提供的標準品濃度及測定的OD值作標準曲線，計算各組血漿樣本濃度，每個樣本均設置2個復孔，取均值統計數據。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0和GraphPad-Prism 5.0統計軟件對研究數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s），采用單因素方差分析和LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠治療前后體質量的變化情況比較 ? 與空白對照比較，模型組體質量明顯升高，而不同劑量的化滯柔肝顆粒可以降低小鼠的體質量，和對照組、低劑量組、易善復組比較，高劑量組降低體質量的效果最佳，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 5組小鼠肝細胞損害改善情況比較 在HFD飲食喂養4周后，HFD模型組的肝切片顯示明顯的空泡狀肝細胞和嚴重的微小和大泡脂肪變性，并有明顯的炎性反應細胞浸潤，通過組織學HE染色證實造成NASH小鼠模型。服藥療程結束后的結果顯示：與安慰劑組劑易善復組比較，化滯柔肝顆?？梢燥@著改善HFD飲食誘導的炎性反應變化，且不同濃度化滯柔肝顆粒的作用呈劑量依賴性。見圖2?；瘻岣晤w?？梢越档脱逯蠥LT的水平，但化滯柔肝顆粒降低AST的水平不明顯。見圖3。

2.3 5組小鼠肝臟脂質沉積情況比較 通過油紅染色的方法來驗證化滯柔肝顆粒對肝臟脂肪變性的改善情況。通過和健康飲食組對照，安慰劑組表現為脂質沉積增加和脂滴積累。研究結果表明，HFD喂養的小鼠肝臟脂肪變性明顯高于空白組。口服不同濃度的化滯柔肝顆粒可以減少HFD喂養的小鼠肝臟中脂滴的數量和大小。見圖4。通過生化試劑盒檢測不同組別小鼠血清中的TG水平，與安慰劑組及易善復組比較，化滯柔肝顆?？山档脱逯蠺G的水平（P<0.05）。見圖5。

2.4 5組小鼠IL-18及IL-1β水平比較 檢測了5組小鼠焦亡相關細胞因子IL-18和IL-1β的水平。結果表明，HFD飲食增加小鼠血清中IL-18和IL-1β的表達水平。和安慰劑組和易善復組比較，不同濃度的化滯柔肝顆?？梢詼p低IL-18和IL-1β的水平，且和劑量有一定的相關性（P<0.05）。見圖6、圖7。

3 討論

隨著人們飲食和生活方式的改變，全球范圍內NASH顯著增加，平均發病年齡下降[6]。目前還沒有完全證實的藥物NASH和肝移植是終末期NASH的唯一治療方案[7]，因此迫切需要找到有效的藥物治療NASH。

既往NASH的發病機制中，很多假設表明NASH是許多因素共同作用的結果，包括遺傳易感性、炎性反應，脂質代謝異常，氧化應激，線粒體功能障礙，細胞因子的產生改變，腸道失調和內質網應激等[8-9]。發病機制中的所有關鍵因素都是潛在治療NASH的靶點[10]，其中炎性反應和脂質代謝異常為NASH發病機制中極其重要的一環，有意思的是在本研究中，我們證明了化滯柔肝顆?？梢詼p弱HFD誘導NASH形成的炎性反應和脂質代謝異常。

目前用于治療納什的療法包括改變生活方式、減肥手術和藥物干預，包括噻唑烷二酮類，維生素E和二甲雙胍等藥物[8]。但是很多人難以維持健康的生活方式，且手術仍然不是大多數人的首選，而上述藥物因為有一些不良反應或多或少收到限制[7]，因此研發有效安全的藥物治療方案顯得尤其重要。在過去的幾十年里，中草藥及其衍生化合物在治療NASH方面由于其高效性和低不良反應風險等優點而廣受關注[11-12]。

中醫并沒有脂肪肝病名，根據病因病機及癥狀將其分為“脅痛”“痰濕”“積聚”等范疇。病理因素為濕熱、痰濁、瘀血，病性為虛實夾雜?；瘻岣晤w?；瘻岣晤w粒主要成分為決明子、大黃、茵陳、澤瀉、陳皮等，具有清熱利濕、化濁解毒、祛瘀柔肝的功效，具有降脂與保肝、標本兼治等作用，目前已經在臨床上治療濕熱蘊結型非酒精性脂肪肝，并取得很好效果[4]。同樣在本研究中，我們證明了化滯柔肝顆?？梢詼p弱HFD誘導NASH形成的炎性反應和脂質代謝，從而得到治療NASH的目的。除了非酒精性脂肪肝，關永霞等[13]的研究指出，化滯柔肝顆粒對酒精聯合脂多糖誘導的酒精性肝炎小鼠有保護作用，后續研究指出酒精性脂肪肝大鼠伴有腸道屏障功能減弱，化滯柔肝顆粒對酒精性脂肪肝大鼠腸道屏障功能及肝臟功能具有雙重保護作用[14]，目前有研究指出化滯柔肝顆?？赏ㄟ^改善胰島素抵抗[15]、改善腸道毒血癥等機制治療非酒精性脂肪肝，但在動物機制方面研究較少，本研究正好填補了這部分空白。

目前細胞焦亡為機制研究的熱點，有研究指出參與了NAFLD的發病及NASH的進展[16]。細胞焦亡是一種新的促炎程序性細胞死亡，它由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nod-like Receptor Protein 3，NLRP3）炎性反應小體促發。NLRP3炎性反應小體是一種細胞內蛋白復合物，可以被多種病原、大分子和環境刺激物激活。有研究指出，高脂血癥及高血糖等刺激物可通過誘發細胞內ROS的釋放，激活的NLRP3，和凋亡相關斑點樣蛋白（Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing CARD，ASC）ASC結合，使caspase-1活化，形成NLRP3炎性反應小體，剪切IL-1β和IL-18成熟，通過GSDMD蛋白形成孔徑，并導致細胞焦亡，引起炎性反應的擴散及疾病的進展。Alegre Fernando等[17]提出，NLRP3誘發的肝細胞焦亡在NASH炎性反應的發生及肝臟纖維化過程中，起著及其重要的作用。作為焦亡的效應細胞因子，IL-1家族細胞因子（IL-1β/IL-18）通過GSDMD孔釋放的炎性反應信號會誘發炎性反應細胞的聚集，再次刺激其他的細胞因子的產生，引起炎性反應擴大化，也有文獻指出肝細胞焦亡釋放的細胞因子IL-18可促進肝星狀細胞（HSCs）的增生和活化，引起肝組織纖維化[18]。而在臨床中，詹忠明等[19]提出檢測IL-18濃度對反映肝細胞損害程度和判斷脂肪肝患兒病情有一定的臨床意義。A.E.Feldstein等[20]通過多中心臨床研究提出，IL-18可作為非酒精性脂肪肝非侵入性診斷檢測指標。在本研究中，我們也發現化滯柔肝顆?？梢詼p弱HFD誘導NASH形成的炎性反應和脂質代謝，且與細胞因子IL-18和IL-1β呈正相關，考慮化滯柔肝顆粒治療NASH的作用可能和焦亡信號通路相關，具體機制有待研究的進一步深入。

綜上所述，化滯柔肝顆粒可以降低HFD誘導NASH形成的ALT和AST水平，且可以降低NASH模型鼠的TG和TC水平，且與細胞因子IL-18和IL-1β呈正相關，可能是化滯柔肝顆粒治療NASH的一個靶點，具體機制有待于研究進一步深入。

參考文獻

[1]Younossi ZM，Koenig AB，Abdelatif D，et al.GIobal epidemiology of nonalcoholic fatty Iiver disease Metanalytic assessment of prevalence，incidence，and outcomes[J].Hepatology，2016，64（1）：73-84.

[2]中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組，中國醫師協會脂肪性肝病專家委員會.非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018年更新版）[J].臨床肝膽病雜志，2018，34（5）：947-957.

[3]Takakura Kazuki，Oikawa Tsunekazu，Nakano Masanori et al.Recent Insights Into the Multiple Pathways Driving Non-alcoholic Steatohepatitis-Derived Hepatocellular Carcinoma.[J].Front Oncol，2019，9：762.

[4]王席玲，趙連山，王曉蕓.化滯柔肝顆粒對濕熱淤積型非酒精性脂肪肝的治療效果[J].世界中醫藥，2018，13（7）：1669-1672.

[5]Shi H，Zhang Y，Xing J，et al.Baicalin attenuates hepatic injury in NASH cell model by suppressing inaflammsome-dependent GSDMD-mediated cell pyroptosis[J].Int Immunopharmacol，2020，3（8）：106195.

[6]Bellentani S.The epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease[J].Liver Int，2017，37 Suppl 1：81-84.

[7]Musso G，Cassader M，Gambino.R.Non-alcoholic steatohepatitis：emerging molecular targets and therapeutic strategies[J].Nature reviews.Drug discovery，2016，15（4）：249-274.

[8]H.Tilg，A.R.Moschen，Evolution of inflflammation in nonalcoholic fatty liver disease：the multiple parallel hits hypothesis，Hepatology 2010，52：1836-1846.

[9]G.Lassailly，R.Caiazzo，F.Pattou，P.Mathurin，Perspectives on treatment for nonalcoholic steatohepatitis[J].Gastroenterology，2016，150（8）：1835-1848.

[10]Rotman Y，Sanyal AJ.Current and upcoming pharmacotherapy for non-alcoholic fatty liver disease[J].Gut，2017，66（1）：180-190.

[11]Guo H X，Liu D H，Ma Y，et al.Long-term baicalin administration ameliorates metabolic disorders and hepatic steatosis in rats given a high-fat diet[J].Acta Pharmacologica Sinica，2009，30（11）：1505-1512.

[12]Duan X，Meng Q，Wang C，et al.Calycosin attenuates triglyceride accumulation and hepatic fifibrosis in murine model of non-alcoholic steatohepatitis via activating farnesoid X receptor[J].Phytomedicine：international journal of phytotherapy and phytopharmacology，2017，25：83-92.

[13]關永霞，李曉梅，張永霞，等.化滯柔肝顆粒對酒精聯合脂多糖誘導的酒精性肝炎小鼠的保護作用[J].實用肝臟病雜志，2015，18（5）：530-533.

[14]李曉梅，孫寶存，劉奮，等.酒精性脂肪肝大鼠腸道屏障功能變化及化滯柔肝顆粒的保護作用[J].實用肝臟病雜志，2014，17（2）：172-175.

[15]李海霞，周全，王麗，等.化滯柔肝顆粒對非酒精性脂肪性肝炎患者胰島素抵抗的影響[J].中成藥，2017，39（8）：1586-1590.

[16]Hirsova P，Gores GJ.Death Receptor-Mediated Cell Death and Proinflammatory Signaling in Nonalcoholic Steatohepatitis[J].Cell Mol Gastroenterol Hepatol，2015，1（1）：17-27.

[17]Alegre Fernando，Pelegrin Pablo，Feldstein Ariel E.Inflammasomes in Liver Fibrosis[J].Seminars in Liver Disease，2017，37（2）：119-127.

[18]Mehal W，Imaeda A.Cell Death and Fibrogenesis[J].Semin Liver Dis，2010，30（3）：226-231.

[19]詹忠明，江永青，胡志堅，等.兒童脂肪肝患者血清IL-18表達水平與肝損傷的關系[J].實驗與檢驗醫學，2017，35（2）：274-275，283.

[20]A.E.Feldstein，A.Wieckowska，A.R.Lopez，et al.Cytokeratin-18 fragment levels as noninvasive biomarkers for nonalcoholic steatohepatitis：a multicenter validation study[J].Hepatology（Baltimore，Md.），2009，50（4）：1865-1866.

（2020-09-18收稿 責任編輯：王楊）