姜黃素對腦缺血再灌注自發性高血壓大鼠認知功能的影響

曾明 許忠 徐凱

摘要 目的：探討姜黃素對腦缺血再灌注自發性高血壓（SH）大鼠認知功能的影響。方法：選取75只大鼠隨機分為假手術組、模型組和實驗組，每組25只;模型組和實驗組構建腦中動脈栓塞（MCAO）模型，假手術組不阻塞大腦中動脈血供;實驗組于術前30 min及再灌注后6 h腹腔注射姜黃素100 mg/kg，假手術組和模型組注射等量生理鹽水。檢測大鼠認知功能、缺血側海馬區神經元凋亡及相關蛋白的表達。結果：缺血再灌注2～72 h，與假手術組比，模型組神經元凋亡細胞數量增多，而實驗組較模型組減少;模型組穿臺次數減少，實驗組多于模型組;模型組逃避潛伏期延長，實驗組短于模型組;模型組缺血側海馬區磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白含量高于假手術組，實驗組PI3K、p-AKT蛋白含量高于模型組，Caspase-3蛋白低于模型組（均P<0.05）。結論：姜黃素可減輕腦缺血再灌注SH大鼠神經元凋亡程度，改善認知功能，其機制與上調PI3K、p-AKT蛋白表達及下調Caspase-3蛋白表達相關。

關鍵詞 高血壓;腦缺血再灌注;姜黃素;神經元凋亡;認知

Abstract Objective：To investigate the effect of curcumin on cognitive function in spontaneously hypertensive （SH） rats with cerebral ischemia reperfusion. Methods：A total of 75 cases of SH rats were selected and randomly divided into a sham operation group， a model group and a test group， with 25 cases in each group. The middle cerebral artery occlusion （MCAO） model was established in model group and test group， while the sham operation group did not block the blood supply of the middle cerebral artery; test group received intraperitoneal injection of curcumin 100 mg·kg-1 at 30 min before operation and 6 h after reperfusion， sham operation group and model group were given intraperitoneal injection of the same amount of normal saline. The cognitive function， neuronal apoptosis and the expression of related proteins in the hippocampus of the ischemic side were detected. Results：After 2 h-72 h of cerebral ischemia and reperfusion， compared with sham operation group， the number of apoptotic neurons in model group increased， while the test group was less than the model group; the number of crossings reduced， and the test group was more than the model group; the escape latency prolonged， and the test group was shorter than the model group; the content of phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）， phosphorylated protein kinase B （p-AKT） and cysteine aspartate protease-3 （Caspase-3） in ischemic side hippocampus of rats in model group were higher than those in sham operation group， while the content of PI3K and p-AKT in test group were higher than model group， Caspase-3 was lower than model group （all P<0.05）. Conclusion：Curcumin can relieve neuronal apoptosis degree and improves cognitive function in SH rats with cerebral ischemia and reperfusion， and the mechanism is related to the up-regulation of PI3K， p-AKT protein and down-regulation of Caspase-3 protein expression.

Keywords Hypertension; Cerebral ischemia reperfusion; Curcumin; Neuronal apoptosis; Cognition

中圖分類號：R285.5;R544.1 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.008

目前缺血性腦卒中已成為嚴重危害人類健康的疾病，而高血壓是腦卒中發生的重要危險因素之一，缺血性腦卒中后常造成腦水腫及腦出血等再灌注損傷，影響了患者預后[1]。姜黃素具有抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性，且具有毒性小，不良反應少等優勢[2]。而目前研究發現，氧化應激、細胞凋亡及炎性反應均是導致腦缺血再灌注損傷的重要機制，因此本研究探討姜黃素對腦缺血再灌注自發性高血壓（SH）大鼠的作用及對海馬神經元凋亡與認知功能的影響[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 由野生型WKY大鼠基因突變后近交繁衍的SPF級SH大鼠，雄性，8周齡，體質量180～220 g，購自南方醫科大學實驗動物中心（合格證號：粵檢證字第2008A053號），所有SH大鼠靜態下尾動脈收縮壓>160 mm Hg（1 mmHg=0.133 kPa）。飼養環境：南方醫科大學實驗動物中心屏障環境動物實驗室，濕度（55±2）%，溫度（25±2）℃，光照明暗時間比為12 h/12 h。本實驗操作遵循實驗動物倫理學要求（倫理審批號：2017421）。

1.1.2 藥物 姜黃素，純度99%，生產批號：050124，美國Sigma-Aldrich公司生產。

1.1.3 試劑與儀器 DNA斷裂的原位末端標記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒（Merck Millipore公司，美國，貨號：AAT-22844）;磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）與磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體（Santa Cruz公司，美國，貨號：FK-CV0876R）;半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase-3）抗體（Cell Singnaling Technology公司，美國，貨號：XY-039-17401）;SH11/YF-9光學顯微鏡（Olypmus公司，日本，SH11/YF-9型）;Meta-Morph凝膠成像分析系統（Media Cybernetics公司，美國，Meta-Morph型）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將75只SH大鼠隨機分為假手術組（n=25）、模型組（n=25）和實驗組（n=25）;模型組和實驗組大鼠采用Longa法構建腦中動脈栓塞（MCAO）模型，假手術組尼龍線栓進線5 mm左右，不阻塞大腦中動脈血供[4]。

1.2.2 給藥方法 實驗組于術前30 min及再灌注后6 h腹腔注射姜黃素100 mg/kg，假手術組和模型組腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 TUNEL法[5]檢測各組大鼠缺血側海馬區神經元凋亡情況 腦缺血再灌注2 h、12 h、24 h及72 h后，每組取出5只斷頭取出腦組織，制作海馬區冠狀石蠟切片，并經脫蠟、水化處理后，按照試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察，并計數每個視野陽性細胞數（200倍視野下），細胞核被染成黃褐色即為凋亡細胞，細胞核為藍色即為正常細胞。

1.2.3.2 Morris水迷宮系統[6]測定各組大鼠認知功能 腦缺血再灌注7 d，采用Morris水迷宮系統測定各組剩余大鼠的認知功能。第1～5天進行定位航行實驗，采用Any-maze動物行為學分析軟件記錄大鼠游泳軌跡及逃避潛伏期（120 s內尋找平臺的時間）;第6天進行空間探索實驗，記錄120 s穿臺次數。

1.2.3.3 蛋白免疫印跡法（WB）[7]檢測各組大鼠缺血側海馬區相關蛋白的表達 取保存的大鼠海馬組織（腦缺血再灌注24 h），制成組織勻漿，電泳后轉膜，加入PI3K、p-AKT、Caspase-3一抗，4 ℃搖床過夜，隨后室溫孵育相對應的二抗1 h。最后用Meta-Morph凝膠成像分析系統分析各條帶灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。計量資料用（±s）表示，組內不同時間點數據分析采用重復測量方差分析，2組間比較進行t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠缺血側海馬區神經元凋亡情況 ? TUNEL細胞染色可見，假手術組大鼠海馬區細胞核核質界限清晰，細胞結構完整，排列均勻;模型組可見細胞染色加深，分布雜亂，神經元周圍大量空泡;實驗組則出現較多正常神經元。腦缺血再灌注2～72 h，各組大鼠海馬區神經元凋亡細胞均呈逐漸升高趨勢（P<0.05）。與假手術組比較，腦缺血再灌注2～72 h模型組大鼠海馬區神經元凋亡細胞數量增多（P<0.05），而腦缺血再灌注12～72 h實驗組大鼠海馬區神經元凋亡細胞數量減少（P<0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠認知功能的比較 假手術組、模型組及實驗組穿臺次數（次）分別為（16.35±3.52）、（7.67±2.14）、（12.41±3.72）。與假手術組比較，模型組穿臺次數顯著減少，第1～5天的逃避潛伏期均延長（P<0.05）;與模型組比較，實驗組穿臺次數顯著增多，第1～5天逃避潛伏期均縮短（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠缺血側海馬區相關蛋白表達 假手術組、模型組及實驗組缺血側海馬區PI3K蛋白相對表達量為（0.65±0.12）、（1.97±0.52）、（2.37±0.42），p-AKT蛋白相對表達量為（0.35±0.09）、（1.94±0.63）、（2.62±0.23），Caspase-3蛋白相對表達量為（0.12±0.05）、（1.86±0.63）、（0.51±0.22）。模型組缺血側海馬區PI3K、p-AKT、Caspase-3蛋白含量均高于假手術組，實驗組缺血側海馬區PI3K、p-AKT蛋白含量高于模型組，Caspase-3蛋白低于模型組（P<0.05）。見圖3。

3 討論

腦缺血后再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要生理病理過程，也是目前臨床研究的熱點[8-9]。腦缺血急性期神經細胞以凋亡與壞死并存，且海馬CA1區對缺血與低氧極為敏感，也是影響患者學習和記憶的關鍵區域[10-11]。本研究結果顯示，腦缺血再灌注損傷后模型組大鼠神經元凋亡細胞數量增多，損傷嚴重，且認知水平降低，提示腦缺血再灌注損傷SH大鼠存在明顯的神經元凋亡及認知缺陷。

姜黃素對肝臟、心臟缺血再灌注損傷具有較好的保護作用，通過下調脂肪氧化酶、環氧化酶-2（COX-2）等因子水平，抑制炎性反應因子的產生;通過下調細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達保護內皮細胞免受腫瘤壞死因子-α（TNF-α）損傷[12-13]。本研究結果中，實驗組大鼠再灌注12 h、24 h、72 h時海馬區神經元凋亡數量均較模型組減少，且認知功能亦有所改善，表明姜黃素在一定程度上可以減輕腦缺血再灌注損傷SH大鼠的神經元凋亡程度，促進大鼠神經功能的恢復，因此認知功能得以改善。PI3K/AKT信號通路是細胞存活的重要的信號通路，也是引起缺血再灌注后細胞凋亡、氧化應激等過程的通路[14-15]，本研究結果中，模型組海馬區PI3K、p-AKT和Caspase-3蛋白表達量增加，表明腦缺血再灌注后激活了海馬區PI3K/AKT信號通路，進而起到神經保護作用，而姜黃素的干預可進一步活化該信號通路，降低Caspase-3凋亡蛋白的表達，表明姜黃素可通過減少海馬區神經元凋亡，增強對大鼠海馬區的保護作用;但是否存在其他的神經保護機制仍需進一步的研究。

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（2020-09-22收稿 責任編輯：蒼寧）