宮頸癌患者Kruppel樣因子6，p21蛋白表達水平與病理特征及化療敏感性的相關性分析

徐曉鋒，王 純，盧國豐，孟亞萍，周勤芬，胡明珠，石 琴

（上海健康醫(yī)學院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院a.婦產(chǎn)科；b.病理科，上海 201800）

近年來，宮頸癌的治療取得明顯突破，但宮頸癌患者的復發(fā)率、死亡率仍然居高不下。手術后同步化療是宮頸癌患者首選的治療方案，但由于個體的化療敏感性差異，部分患者未能從化療中獲益，治療難度大[1]。尋找一種科學、可行的途徑篩選化療敏感患者增強化療療效，改善預后一直是宮頸癌治療領域的研究熱點[2-3]。Kruppel 樣因子6（KLF6），p21 蛋白均為抑癌基因，研究認為其與細胞增殖、分化及血管生成等調控過程密切相關，同時參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但國內關于二者表達水平與宮頸癌患者化療敏感性的關系及作用機制研究仍鮮有報道，具有較大研究價值[4-5]。本研究擬采用免疫組化染色法檢測宮頸癌患者KLF6，p21 蛋白的表達，探討其對化療敏感性的評估價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2016年1月～2018年12月我院婦科收治的40 例宮頸癌患者。入組標準：①均經(jīng)影像學檢查及組織病理確診，且臨床資料完整；②臨床分期為II～Ⅳ期，均接受同步化療，預計存活期超過3 個月；③排除化療藥物過敏、并發(fā)化療禁忌癥、精神障礙、嚴重心肝腎功能障礙者。年齡42～74（56.22±5.19）歲；病理類型：鱗癌14例，腺癌26 例；低分化者13 例，中分化者19 例，高分化者8 例。

1.2 儀器與試劑 鼠抗人KLF6 多克隆抗體、鼠抗人p21 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。

1.3 方法

1.3.1 化療方法：所有患者均接受TC 化療方案：卡鉑（山東齊魯藥業(yè)，批準文號：國藥準字H10920028）按照曲線下面積（AUC）=5 計算劑量后靜脈滴注，d1；紫杉醇（意大利百時美施貴寶公司，批準文號：國藥準字H20020582）175 mg/m2靜脈滴注，d1；3 周為1 個療程，共3 個療程。

1.3.2 觀察指標

1.3.2.1 KLF6，p21 蛋白表達：測定所有宮頸癌組織標本均以甲醛固定，石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟、染色。采用免疫組化Enivison 二步法檢測，KLF6，p21 蛋白分別采用鼠抗人KLF6 多克隆抗體、鼠抗人p21 單克隆抗體，工作濃度分別為1:300，1:100。陽性對照采用已知標準片，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。

1.3.2.2 免疫組化結果判定：將染色強度分為4 個等級，其中無染色為0 分，淺黃色為1 分，黃褐色為2 分，棕褐色為3 分；高倍光鏡下觀察染色的陽性細胞范圍，百分比≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，≥51%為3 分。根據(jù)染色強度、陽性細胞比例二者得分乘積計算陽性強度：0～1 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～6 分為中陽性（++），＞6 分為強陽性（+++）。

1.3.3 化療敏感性評估：以化療效果為基礎，參照1.1 版實體瘤療效評價標準[6]評估化療敏感性。完全緩解(CR)：原發(fā)腫瘤病灶完全消失；部分緩解(PR)：原發(fā)腫瘤病灶最大徑及其最大垂直徑的乘積下降超過50%，且維持4 周以上；病變穩(wěn)定（SD）：原發(fā)腫瘤病灶兩徑乘積下降25%～50%，未見新發(fā)病灶，且維持4周以上；病變進展（PD）：原發(fā)腫瘤病灶兩徑乘積增加超過25%，或可見新發(fā)病灶。其中，CR，PR 納入化療敏感組[即客觀緩解率（ORR）=(CR+PR)/ 總病例數(shù)×100%]，SD，PD納入化療抵抗組。

1.3.4 隨訪：化療后通過電話、門診復查或入戶等形式進行隨訪，了解患者病情進展情況及死亡的具體死因。總生存期(OS)是指從初次治療至死亡或隨訪截止之間的時間，隨訪截止時間為2020年3月。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0 版統(tǒng)計軟件包，計數(shù)資料以陽性率（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 生存分析法分析KLF6，p21 蛋白表達與OS 的相關性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者KLF6，p21 蛋白陽性表達與臨床病理特征的相關性 見表1。宮頸癌中KLF6，p21 蛋白陽性率與病理分期、腫瘤直徑、分化類型及化療敏感性相關，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而與年齡無顯著相關性（P＞0.05）。

2.2 KLF6，p21 聯(lián)合檢測與宮頸癌化療敏感性關系KLF6+/p21- 者ORR(CR+PR) 為85.71%(18/21)，SD+PD 為14.29(3/21)，顯著高于非KLF6+/p21-者42.11%(8/19)，SD+PD 為57.89%(11/19),差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.33，P＜0.05）。

2.3 宮頸癌KLF6，p21 蛋白陽性表達與OS 的相關性 見圖1，圖2。Kaplan-Meier 法顯示，宮頸癌患者的中位OS 為11.20 個月（95%CI: 9.73～12.71），其中KLF6 陽性者中位OS 為11.90 個月（95%CI:10.81～12.99），KLF6 陰性表達者中位OS 為9.20個月（95%CI: 9.05～9.35）。p21 蛋白陽性者中位OS為9.14 個月（95%CI: 8.26～10.22），p21 蛋白陰性表達者中位OS 為11.62 個月（95%CI: 9.63～13.58）。經(jīng)log-rank 檢驗，KLF6 陽性者的中位OS 顯著高于陰性表達者，而p21 蛋白陽性者的中位OS 顯著低于陰性表達者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=11.50，6.23，均P＜0.05）。

表1 宮頸癌患者KLF6，p21 蛋白陽性表達與臨床病理特征的相關性

圖1 宮頸癌患者KLF6 蛋白表達水平與OS 的關系

圖2 宮頸癌患者p21 蛋白表達水平與OS 的關系

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率不斷升高，且發(fā)病年齡也趨于年輕化，其原因尚不完全清楚，研究認為可能與基因的缺失或異常表達有關[7]。TC 方案是宮頸癌患者常用的化療方式，主要通過結合細胞DNA 形成穩(wěn)定加和物導致DNA 損傷，阻斷腫瘤細胞惡性增殖。NCCN 指南推薦將以順鉑為基礎的每周化療方案用于復發(fā)或轉移性宮頸癌一線治療，可將此類患者5年無復發(fā)生存率提高20%[8]。但由于個體差異性，部分患者對化療藥物的敏感性較低，經(jīng)足量化療后腫瘤消退仍不令人滿意，且往往預后不佳。

KLF6 基因是普遍表達的鋅指轉錄因子9，研究顯示其對心肺等組織器官生長發(fā)育、血管生成具有誘導作用，還可通過蛋白酶依賴途徑、Rb 通路以及與多種基因啟動子結合的方式調節(jié)細胞凋亡、增殖及分化等過程[9]。ZHANG 等[10]研究表明，KLF6 基因在腎細胞癌、肺癌等多種惡性腫瘤中的突變和向下調節(jié)作用，與浸潤深度、分化程度及同步放化療敏感性有關。p21 蛋白作為一種細胞周期依賴激酶（CDK）抑制物，通過CDK 抑制細胞分裂，阻斷細胞周期從G 期向S 期的過渡，從而抑制細胞生長。研究發(fā)現(xiàn)，p21 可調節(jié)細胞周期與DNA 復制、修復之間的關系，與惡性腫瘤緩解率、治療效果有關，并可作為判斷預后的重要指標[11]。本研究結果顯示，宮頸癌中KLF6，p21 蛋白陽性率與病理分期、腫瘤直徑、分化類型及化療敏感性相關（P＜0.05），KLF6 高表達、p21 蛋白低表達者化療敏感性更高，與WANG 等[12]研究結果相符。有研究認為，p21是KLF6 的直接靶基因，KLF6 通過非p53 依賴通路上調p21，促進CDK 對細胞周期的阻滯作用，從而抑制細胞增殖[13-14]。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，KLF6+/p21-者ORR 為85.71%，顯著高于非KLF6+/p21-者的42.11%（P＜0.05），表明KLF6 高表達且p21 蛋白低表達者化療敏感性最高，二者聯(lián)合檢測可作為宮頸癌患者化療敏感性的預測指標。生存分析顯示，宮頸癌患者的中位OS 為11.20 個月（95%CI: 9.73～12.71），其中KLF6 陽性表達、p21 蛋白陰性表達者中位OS 顯著高于KLF6陰性表達、p21蛋白陽性表達者（P＜0.05），表明KLF6，p21 蛋白表達水平均可作為宮頸癌的獨立預后因素，與車亞等[15]研究結果基本一致。由此可見，檢測KLF6，p21 表達有助于篩查完全宮頸癌化療敏感患者，同時可用于化療的近遠期療效預測，從而優(yōu)化治療方案，進一步提高治療效果。

綜上所述，宮頸癌患者KLF6，p21 蛋白表達水平與其臨床病理特征相關，KLF6 高表達、p21蛋白低表達者化療敏感性高，且預后更好，可作為預后、個體化治療方案選擇的評價指標。