乙型病毒性肝炎與原發(fā)性膽汁性膽管炎患者血清抗線粒體抗體M2亞型表達的特征分析

趙 敏,李勤光，卓傳尚（福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院檢驗科，福州 350025）

抗線粒體抗體（AMA)是一種無種屬特異性也無器官特異性的自身抗體由MAOKEY 等于1958年首次發(fā)現(xiàn)于原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC)患者血清中，根據(jù)靶抗原的不同可以分為M1 ～M9 幾種亞型。其中抗線粒體抗體M2亞型（AMA-M2）為診斷PBC 的特異性抗體，相關報道表明AMA-M2 可見于95%的PBC 病人，敏感度可達90%[1]。有多個文獻報道[2-4]乙型病毒性肝炎患者中亦可出現(xiàn)AMA-M2 亞型的表達，LI 等[5]報道325 例慢性乙肝病人中有6.8%的患者檢測到AMA-M2 抗體。由于AMA-M2 陽性對臨床診斷PBC 的傾向性較明顯，目前臨床上M2 陽性乙型病毒性肝炎患者常需要進行肝組織穿刺活檢來鑒別診斷是否并發(fā)PBC。然而，肝組織穿刺活檢是一種侵入性操作，少數(shù)病例可發(fā)生嚴重的并發(fā)癥乃至死亡，其次肝穿刺采樣僅為肝臟質(zhì)量的五萬分之一，存在一定的采樣誤差。因此需要其他無創(chuàng)方法替代或彌補肝穿刺組織活檢的不足。由于慢性乙型肝炎和PBC 的發(fā)病機制不同，因此二者免疫學和生化特征可能亦有差別。本文回顧性分析174 例AMA-M2陽性慢性乙型肝炎和PBC 病人的免疫學指標和血清生物化學特征，為臨床AMA-M2 陽性慢性乙型肝炎和PBC 的鑒別診斷提供可能的新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月～2018年6月期間在福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院就診的174 例M2陽性肝功能異常病例，包括單純乙型病毒性肝炎，原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)和乙型病毒性肝炎合并PBC 等。PBC 診斷依據(jù)2015年中華醫(yī)學會分會PBC 診斷指導建議[6]，乙型病毒性肝炎診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年更新版）[7]。乙型病毒性肝炎并發(fā)PBC 診斷依據(jù)乙肝診斷標準外，均結(jié)合肝活組織病理檢查來確診。

1.2 試劑與儀器 自身抗體檢測使用歐蒙（杭州）醫(yī)學診斷實驗公司自身抗體IgG 檢測試劑盒，亞輝龍自身免疫性肝病抗體普檢測試劑盒，亞輝龍全自動免疫印跡分析儀(Tenfly Auto)，奧林巴斯熒光顯微鏡（BX51)；生化指標檢測使用貝克曼公司AU5800 全自動生化分析儀及配套檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 AMA-M2 檢測：使用亞輝龍全自動免疫印跡分析儀及配套的自身免疫性肝病抗體譜檢測試劑盒，加樣后儀器自動進行樣本的孵育、洗滌、加液、烘干、結(jié)果掃描、輸出。結(jié)果判讀依據(jù)試劑說明書，M2 條帶著色淺于臨界質(zhì)控條帶則判斷為陰性，在臨界質(zhì)控條帶與陽性條帶之間則判斷為弱陽性，大于陽性條帶則判斷為陽性。

1.3.2 抗核抗體檢測：使用德國歐蒙間接免疫熒光法檢測試劑盒，選用HEP-2，鼠腎、猴肝、鼠胃四種基質(zhì)。待測血清自1∶100 起稀釋并按試劑說明書操作后在熒光顯微鏡下進行判讀抗核抗體（ANA)核型、抗線粒體抗體、抗平滑肌抗體及其相應的滴度。

1.3.3 肝功能、血脂等生化指標檢測： 應用貝克曼公司AU5800 全自動生化分析儀及配套檢測試劑檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽汁酸（TBA）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HLD）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.3.4 免疫球蛋白IgG,IgM 抗體檢測：使用西門子公司全自動蛋白分析儀（BNⅡ)及配套檢測試劑盒。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計學處理。生化、免疫球蛋白等非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(P25～P75)來描述，使用非參數(shù)秩和檢驗進行對比分析；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比來描述，使用卡方檢驗進行對比分析；ANA 和AMA 陽性率及滴度分布屬于單向有序等級資料，采用秩和檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AMA-M2 陽性各組患者的一般資料與生化指標檢測結(jié)果 見表1。37 例單純乙型病毒性肝炎（乙肝組），129 例PBC（PBC 組）和8 例乙型病毒性肝炎并發(fā)PBC（乙肝并發(fā)PBC)。乙肝組男女患者比例為1.46∶1，PBC 組和乙肝并發(fā)PBC 組男女比例分別為0.23∶1 和0.14∶1。經(jīng)兩兩比較PBC 組與乙肝組之間男女構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=23.95，P＜0.01）。三組間年齡分布差異無統(tǒng)計學意義。

除總膽汁酸（TBA）和IgG 抗體外，三組患者血清生化指標和免疫球蛋白水平的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較分析顯示，乙肝組的血清ALT 水平高于PBC 組，差異有統(tǒng)計學意義（U=1 826.5，P＜0.05），AST 水平高于PBC 組但差異無統(tǒng)計學意義。PBC 組血清GGT，ALP，TG，TC，HDL 和IgM 等水平高于乙肝組，差異均有統(tǒng)計學意義（U 分別為1 210.0，1 608.0，1 830.5，1 244.5，1 678.5 和717.5，均P＜0.01）。PBC 組與乙肝并發(fā)PBC 組ALT, AST 水平差異具有統(tǒng)計學意義（U=253～281,均P＜0.05)。

表1 AMA-M2 陽性三組患者一般特征及生化指標檢測結(jié)果[(±s),M(P25～P75)]

表1 AMA-M2 陽性三組患者一般特征及生化指標檢測結(jié)果[(±s),M(P25～P75)]

注：*PBC 組與乙肝組相比P＜0.05,**PBC 組與乙肝組相比P＜0.01；▼乙肝組與乙肝并發(fā)PBC 組相比P＜0.05,▼▼乙肝組與乙肝并發(fā)PBC 組相比P＜0.01;▽PBC 組與PBC 并發(fā)乙肝組相比P＜0.05。

項目 PBC 組（n=129） 乙肝組（n=37） 乙肝并發(fā)PBC 組（n=8） χ2/F P性別（男/女） 24/105 22/15 1/7 25.23 ＜0.001年齡（歲） 55.46±10.34 50.54±13.46 58.75±17.18 2.02 0.111 GGT（U/L) 217（95～501）** 80（48～159)▼▼ 258（141～304.5） 2.31 ＜0.001 ALT(U/L) 59（32～106）* 101（39～218)▼ 29（20～49）▽ 9.46 0.009 AST(U/L) 74（42～113） 83（45～226)▼ 37.5（23.5～62.5）▽ 8.41 0.015 ALP(U/L) 225（141～353）** 144（103～235) 146（103.5～198） 1.23 0.001 TBA(μmol/L) 30.5（10.5～140.5） 22（11.8～105.9） 10.9（6.7～70.35） 3.01 0.222 TG(mmol/L) 1.3（0.9～1.9）* 1.06（0.81～1.43） 1.16（0.97～1.73） 4.82 0.09 TC(mmol/L) 5.53（4.19～7.03）** 3.87（2.69～4.61） 4.9（3.71～5.59） 20.85 ＜0.001 HLD(mmol/L) 1.22（0.72～1.79）* 0.93（0.29～1.26） 1.16（1.03～1.33） 7.80 0.020 LDL(mmol/L) 2.49（1.93～3.39）** 1.9（1.47～2.43） 2.34（2.11～2.87） 9.95 0.007 IgM(g/L) 3.36（2.26～4.11）** 1.34（1.09～1.56）▼▼ 2.96（2.38～3.47） 42.00 ＜0.001 IgG(g/L) 16.5（13.9～20.1） 16.9（13.3～22.4） 18.75（16.55～24.25） 1.55 0.459

2.2 AMA-M2 陽性各組患者M2 弱陽性與陽性構(gòu)成比比較 見表2。PBC 組、乙肝組和乙肝并發(fā)PBC 組間的M2 弱陽性與陽性構(gòu)成比差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=57.154，P＜0.001),乙肝組M2 抗體以弱陽性為主（70.3%），PBC 組與乙肝并發(fā)PBC 組以陽性為主（88.4%，100%）。

表 2 三組間M2 抗體弱陽性與陽性構(gòu)成比[n(%)]

2.3 AMA-M2 陽性各組患者抗核抗體（ANA）陽性率及滴度分布 見表2。AMA-M2 陽性的PBC、乙肝和乙肝并發(fā)PBC 的ANA 陽性率分別為98.45%（127/129）、67.57%（25/37）和100%（8/8)，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=28.421，P＜0.001）。三組間ANA 滴度分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=112.28，P＜0.001），PBC 組和乙肝并發(fā)PBC 組ANA 高滴度(≥1:320)比率分別為98.4%（125/127）和100%（8/8），均高于乙肝組的48%（12/25），差異均有統(tǒng)計學意義（U 值分別為22.0，367.0，均P＜0.01）。

表3 三組間抗核抗體（ANA）陽性率及滴度[n(%)]分布

2.4 AMA-M2 陽性各組患者抗線粒體抗體(AMA)陽性率及滴度分布 見表4。AMA-M2 陽性的PBC，乙肝和乙肝并發(fā)PBC 的總AMA 陽性率分別為93.02%，21.62%和100%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14.575，P=0.001）。此外，三組間AMA 滴度比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=104.37，P＜0.001)。兩兩比較顯示PBC 組和乙肝并發(fā)PBC 組AMA 滴度分布差異均無統(tǒng)計學意義（U=0.020，P=0.888），但均高于乙肝組（U 值分別為6.50 和283.5，均P＜0.01）。

3 討論

慢性HBV 感染的發(fā)病機制較為復雜，迄今尚未闡明，普遍觀點認為HBV 病毒引起的免疫應答是造成肝細胞損傷及炎癥壞死的主要機制[6,8]。并有多個報道表明可在乙肝患者中檢測到多種自身抗體，包括AMA-M2[9-10]。AMA-M2 抗體是診斷原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）的特異性指標。因此乙肝患者中檢測出AMA-M2 常給臨床診斷造成困擾。文獻推測乙肝患者中檢測出AMA-M2 的原因可能是乙型肝炎病毒引起的自身免疫反應或病毒性乙型肝炎并發(fā)PBC。本研究中有45 例病毒性乙型肝炎同時M2 抗體陽性的病例，通過臨床表現(xiàn)、實驗室指標、病理診斷等綜合判斷其中有8 例最終診斷為病毒性乙型肝炎并發(fā)PBC。根據(jù)乙肝病人和PBC病人各自的臨床、實驗室指標特點本文從以下幾個方面進行分析，希望對臨床上M2 陽性乙肝病人是否合并PBC 的鑒別診斷提供可能的參考依據(jù)。

表4 三組間抗線粒體抗體陽性率及滴度[n(%)]分布

PBC 好發(fā)于中年女性，患病年齡高峰期為40 ～60 歲[11]，而乙型病毒性肝炎患者中男性比例高于女性[12]，本文中的PBC 組與單純乙肝組性別構(gòu)成與以上特點相符。本研究中M2 陽性的PBC 組的ANA，AMA 以高滴度(≥1∶320）為主，而乙肝組主要以低滴度（≤1∶100）為主，而乙肝并發(fā)PBC 組自身抗體譜模式與PBC 組相似。這一結(jié)果與以往孫麗梅等[13]的研究一致，這些結(jié)果表明低滴度的ANA，AMA，M2 抗體陽性診斷PBC 的意義不大，而乙型肝炎患者若檢測高滴度的ANA，AMA，M2 抗體多為乙型肝炎并發(fā)PBC，若檢測到低滴度的ANA，AMA，M2 抗體則單純性乙型肝炎可能性較大，自身抗體譜的陽性可能為乙型肝炎病毒引起的自身免疫性反應。由于本研究屬回顧性橫斷面研究，未對低滴度M2 抗體陽性的乙型肝炎患者進行縱向研究，因此不清楚這些所謂的單純性乙型肝炎患者自身抗體譜是否會隨著病情進展而改變，或是否會進展為并發(fā)PBC，有待后續(xù)進一步研究。此外，M2 抗體為AMA 抗體中一個亞型，M2陽性而AMA 抗體陰性有可能因為M2 抗體檢測使用的免疫印跡法靈敏度、特異度與AMA 抗體檢測的間接免疫熒光法存在差別造成兩種檢測方法的陽性率不符。相關報道表明聯(lián)合M2 抗體和AMA抗體檢測可提高診斷PBC 的準確度[14]，本文中乙肝組AMA-M2 與AMA 同時陽性的概率為21.62%（8/37），要遠低于PBC 組的93.02%(120/127)及乙肝并發(fā)PBC 組的100%（8/8）。

由于病毒性乙型肝炎和原發(fā)性膽汁性膽管炎的病理基礎不同，前者以肝細胞破壞為主，后者是以肝內(nèi)膽小管進行性破壞為主要病變的非化膿性膽管炎，進而導致膽汁淤積，因此雖然兩種疾病患者的酶學、膽紅素代謝和脂代謝等生化指標均有不同程度的改變卻各有特點，正如本研究所顯示的，乙型肝炎患者的肝細胞炎癥指標ALT 和AST 升高顯著高于PBC 患者，PBC 患者則以反映膽汁淤積或膽管炎癥等指標（如GGT，ALP 等）升高較乙型肝炎患者明顯，而乙型肝炎并發(fā)PBC 患者，這些指標的改變兼有二者的特點。上述結(jié)果與周曉冬等[15]報道相符。由于膽紅素可影響脂代謝，相關報道表明PBC 病人常并發(fā)以TC, TG, LDL 升高為主的血脂異常[16]，本文中乙肝組TG, TC, HLD, LDL 水平均低于PBC 組，但乙肝組與乙肝并發(fā)PBC 組間血脂水平無顯著差異，這給病毒性乙型肝炎是否并發(fā)PBC 鑒別診斷造成一定的困難。此外，IgM 升高是PBC 實驗室特征之一，此研究中乙肝組IgM 水平顯著低于PBC 組和乙肝并發(fā)PBC 組，與李青梅等[17]報道一致。

綜上所述，M2 抗體并非僅出現(xiàn)于PBC 患者中，也可出現(xiàn)于病毒性乙型肝炎等非PBC 患者中。因此臨床上病毒性乙肝患者出現(xiàn)M2 抗體陽性需注意鑒別診斷是否并發(fā)PBC：首先，單純M2 陽性乙肝病人抗核抗體、AMA 抗體多以低滴度為主，且M2抗體多為弱陽性，而乙型肝炎并發(fā)PBC 者的抗核抗體、AMA 抗體多為高滴度陽性；其次，單純M2陽性乙肝病人ALT 升高較為明顯，若血清GGT,ALP, IgM 水平升高較為明顯且血脂異常者則并發(fā)PBC 的可能比較大。