LncRNATUG1在甲狀腺癌組織中的表達及其對細胞增殖和遷移的影響

趙芳芳，郭 紅，陳 嘉（漢中市人民醫院內分泌科，陜西漢中 723000）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是來源于甲狀腺上皮細胞的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，其發病呈年輕化趨勢，女性多發于男性[1]。臨床上對TC 患者的治療有腫瘤切除、藥物靶向治療、化療放療等手段，但治療過程中仍然存在預后差等問題[2]，對患者的健康和生活質量產生嚴重影響。因此，進一步了解和揭示TC 的發生發展機制，找尋更多特異性分子標志物及治療靶點，對臨床診治意義重大。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一段長度大于200 個核苷酸的RNA 序列，已被證實是癌癥發生發展的關鍵調節因子[3-4]。牛磺酸上調基因1（taurine upregulated gene 1，TUG1） 是位于染色體22q12的一種LncRNA[5]，據報道LncRNA TUG1 已在多種癌癥中表達上調，與癌癥發生發展、細胞耐藥及預后密切相關，如LncRNA TUG1 通過EZH2 調控LIMK2b 參與小細胞肺癌的細胞生長和化療耐藥性[6]；Meta 分析顯示，lncRNA TUG1 升高是腫瘤患者不良總生存期（overall survival，OS）的獨立預后標志物[7]；lncRNA TUG1 通過WNT/ catenin 通路促進上皮性卵巢癌細胞增殖和侵襲[8]。然而LncRNA TUG1 在TC 中的功能機制目前仍不清楚，因此，本研究探究了LncRNA TUG1 在TC 組織及細胞中的表達及其對細胞增殖、遷移、侵襲的作用，并初步探索其調控TC 發生發展的作用機制，為TC 的分子靶向治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月～2018年6月于我院進行腫瘤切除手術治療并經病例確診的36 例TC 組織標本（未分化癌5 例，濾泡狀癌25 例，乳頭狀癌6 例）及其相對應正常的癌旁甲狀腺組織。從ATCC 公司購買人TC 細胞株SW1736 和FTC-133 以及人正常甲狀腺上皮細胞Nthy-ori 3-1，含10ml/dl 胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養基（DMEM）中培養。

1.2 試劑和儀器 酶聯免疫檢測儀購自美國 BioTek公司。PCR 擴增儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Lipofectamine 2000 試劑盒及Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司。PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒及SYBR Prime Script RT-PCR Kit 試劑盒購自日本Takara 公司。DMEM 培養基購自美國 HyClone公司。6 孔板、96 孔板及Transwell 小室購自美國Corning 公司。E-cadherin 抗體、N-cadherin 抗體和GAPDH 抗體購自美國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）：用Trizol 試劑提取組織和細胞的總RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit 根據說明書進行逆 轉 錄。 使 用SYBR Prime Script RT-PCR Kit 進行qRT-PCR。引物如下，LncRNA TUG1 正向：5’-CTATACTCAGCTTCAGTGTT-3’，反向：5’-TA CTGTATGGCCACCACTCC-3’；GAPDH 正向：5’-GAAGGCTGGGGCTCATTTGCAGGG-3’， 反 向：5’-GGTGCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’。對純 化的RNA 進行qRT-PCR 分析，并用GAPDH 內參進行校正。

1.3.2 LncRNA TUG1 低表達細胞系模型構建：將shRNA 插入慢病毒質粒中構建LncRNA TUG1 低表達質粒（LV-shTUG1），以插入無意義序列的慢病毒載體（negative control）作為對照。使用LipofectamineTM2000 試劑盒（Invitrogen）按照說明書步驟將低表達質粒及對照質粒轉染至細胞SW1736和FTC133 中。

1.3.3 MTT 實驗和集落形成實驗檢測細胞增殖：MTT 法：將細胞接種于96 孔板培養24 h，利用pcDNA3.1 轉染細胞，轉染后0，24，48，72 和96 h，向每孔加入20 μl MTT 溶液，室溫孵育4 h，除去培養基，每孔加入100 μl DMSO，于560 nm處測量吸光度（A）。集落形成實驗：將細胞以500 個/孔濃度接種于6 孔板，在含10 ml/dl 胎牛血清的DMEM 中37 ℃溫育兩周，后固定細胞，0.1 g/dl 結晶紫染色，計數可見菌落數。

1.3.4 Transwell 試驗檢測細胞遷移：將含有5×104個細胞的細胞懸液置于Transwell 小室的上室，含10 ml/dl 胎牛血清的培養基加入Transwell 小室的下室，溫育48 h，擦去殘留在上膜中的細胞，用甲醇固定遷移過膜的細胞，下層細胞用0.1 g/dl 結晶紫染色并在顯微鏡下計數。

1.3.5 Western blot 檢測EMT 相關蛋白表達：取轉染后細胞，使用RIPA 裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，將提取蛋白與上樣緩沖液混合，于10 g/dl SDS-PAGE 電泳，轉移至PVDF 膜，5 g/dl BSA 室溫封閉2 h，加入E-cadherin（1∶2000），N-cadherin（1∶2 000）一抗，室溫孵育4 h，TBST洗膜3 次；加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min，使用增強的化學發光檢測試劑盒檢測信號，使用Tanon 5200 化學發光成像系統進行分析。

1.4 統計學分析 使用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，LncRNA TUG1 在甲狀腺癌組織及癌旁組織中的表達差異應用配對樣本t 檢驗；各細胞組間差異比較采用獨立樣本t 檢驗進行分析，P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA TUG1 在TC 組織及細胞中高表達 見圖1。采用qRT-PCR 法檢測顯示，與癌旁正常組織相比，癌組織中LncRNA TUG1 表達（1.51±1.02 vs 6.90±1.19）顯著升高，差異有統計學意義（t=20.634，P ＜0.000）；與正常甲狀腺上皮Nthy-ori 3-1 細胞相比，FTC-133 細胞（1.00±0.09 vs 4.61±0.15）和SW1736 細胞（1.00±0.09 vs 2.59±0.23）中LncRNA TUG1 水平明顯升高，差異有統計學意義（t=35.744，P ＜0.000；t=11.150，P ＜0.000）。

圖1 qRT-PCR 法檢測TC 組織及細胞中LncRNA TUG1 的表達水平（**P＜0.01）

2.2 敲降 LncRNA TUG1 表達抑制TC 細胞的增殖 見圖2，圖3。MTT 和集落形成實驗檢測顯示，與對照組相比，敲降LncRNA TUG1 表達后SW1736 細胞（1.31±0.19 vs 0.89±0.16）和FTC-133 細胞（2.17±0.09 vs 1.68±0.05）增殖能力明顯降低，克隆形成數目明顯減少，差異有統計學意義（t=2.929，P=0.021；t=8.243，P=0.001）。

圖3 集落形成實驗檢測敲降LncRNA TUG1 表達對TC 細胞克隆形成能力的影響

2.3 敲降 LncRNA TUG1 表達抑制TC 細胞的遷移 見圖4。以FTC-133 細胞為例，Transwell 實驗檢測顯示，與對照組相比，敲降LncRNA TUG1表達后，FTC-133 細胞遷移能力（1 675.2±64.2 vs 898.1±156.4）顯著降低，差異有統計學意義 （t=7.961，P=0.001）。

圖4 敲降LncRNA TUG1 表達對FTC-133 細胞遷移的影響（*P＜0.05）

2.4 敲降LncRNA TUG1 表達抑制TC 細胞EMT 的形成 見圖5。采用Western blot 檢測EMT 相關蛋白E-cadherin 和N-cadherin 的表達情況，結果顯示：與對照組相比，敲降 LncRNA TUG1 表達后E-cadherin 表達量（0.74±0.06 vs 1.66±0.17）顯著升高，N-cadherin 表達量（1.27±0.18 vs 0.39±0. 07）顯著降低，差異有統計學意義（t=8.839，P ＜0.000；t=7.892，P=0.001）。提示LncRNA TUG1 促進TC細胞EMT 形成。

圖5 LncRNA TUG1 調節EMT 相關蛋白的表達（**P＜0.01）

3 討論

TC 是由機體碘缺乏、輻射、遺傳等因素引起的最常見的惡性腫瘤之一，近年發病率呈逐年上升趨勢[1]，但其具體的發病機制目前尚不清楚。LncRNA 通過多種途徑調控基因表達及相關信號通路，進而調控腫瘤細胞的生物學行為，參與癌癥的發生發展，被認為是多種癌癥的關鍵調節因子[9]。深入研究LncRNA 與TC 發生發展間的關系，可以為TC 的分子診斷、靶向治療及預測預后提供一定借鑒。

LncRNA 在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平上參與基因表達的調控[10]，被廣泛報道通過多種機制調節病理生理過程，如基因印記，組蛋白修飾，染色質重塑，轉錄激活[11]等。并發現LncRNA 可通過與微小RNA（miRNA）競爭性結合并因此抑制其功能（即阻斷與靶mRNA 的相互作用）[11]。大量研究發現，LncRNAs 在眾多不同疾病類型中均差異表達，通過多種途徑參與調控腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移等惡性生物學行為，誘導癌癥的惡性進展，表現為原癌基因或抑癌基因發揮作用[12-16]。LncRNA TUG1 最初被鑒定為是由牛磺酸上調的轉錄物，在許多癌癥中已經報道了LncRNA TUG1 的異常表達，發現TUG1 可通過招募某些RNA 結合蛋白，進而促進靶基因表達，影響腫瘤血管生成或充當競爭性內源性RNA（ceRNA）調控腫瘤的發生發展[5]。CAO 等[17]研究發現，LncRNA TUG1 是骨肉瘤患者存活的預后因素。LncRNA TUG1 高表達與膀胱癌和食管鱗癌細胞的增殖和轉移有關[18-19]。NIU 等[6]研究發現，LncRNA TUG1 通 過EZH2調控LIMK2b 參與小細胞肺癌的細胞生長和化療耐藥性。LI 等[20]發現， LncRNA TUG1 通過與PRC2結合調節胃癌細胞增殖。WANG 等[21]研究發現，LncRNA TUG1 通過EMT 途徑促進結腸直腸癌的轉移。由此可見，LncRNA TUG1 在調節多種轉錄因子和生理過程中具有重要意義，提示TUG1 有望成為眾多腫瘤診斷及預后的生物標志物或治療新靶點。因此，研究LncRNA TUG1 在TC 中發揮的功能及其分子機制對尋找新的治療靶點至關重要。

本研究應用qRT-PCR 檢測發現TC 組織及細胞中LncRNA TUG1 表達水平較癌旁正常組織及正常甲狀腺上皮細胞明顯升高（P＜0.05），提示LncRNA TUG1 與TC 的發生發展密切相關。將shRNA 插入慢病毒質粒構建LncRNA TUG1 低表達細胞系，采用MTT 法、集落形成實驗、Transwell實驗于細胞水平檢測發現敲降LncRNA TUG1 表達明顯抑制TC 細胞的增殖及遷移能力（P＜0.05），提示TC 中LncRNA TUG1 扮演促癌基因。EMT 是上皮細胞獲得遷移能力的有效方式，也是TC 細胞浸潤轉移的重要形式，因此本研究通過蛋白印跡探究了LncRNA TUG1 表達對TC 細胞EMT 形成的影響，發現敲降LncRNA TUG1 表達抑制了EMT 形成。表明LncRNA TUG1 在TC 中高表達，促進細胞的增殖及遷移，可能通過促進EMT 的形成進而發揮作用。本研究初步證明了LncRNA TUG1 通過調控EMT 形成參與TC 的發生發展，然而腫瘤的形成是一個復雜的調控過程，TUG1 調控腫瘤發生發展的方式多樣，必定涉及多種基因或因子的相互調節及信號轉導通路，其調控TC 惡性發展進程的分子機制還需進一步深入探究分析闡明。此外，包含TUG1 在內的多個LncRNA 近年被研究報道能夠調控腫瘤能量代謝影響腫瘤惡性行為，其中LIN 等[22]在Hepatoligy 上報道TUG1 可調控肝癌細胞的糖酵解能力，影響癌細胞增殖、遷移。HAN 等[23]研究指出， LncRNA TUG1 通過調節糖酵解作用影響骨肉瘤細胞的存活率。徐蘇娟等[24]通過Seahorse能量分析儀對卵巢癌OVCAR3 細胞糖酵解壓力及線粒體壓力變化，顯示干擾TUG1 表達能顯著降低癌細胞的線粒體呼吸和糖酵解通量，指出卵巢癌細胞的增殖及遷移可能與TUG1 調控腫瘤能量代謝有關。目前，糖酵解作為腫瘤能量來源已被廣泛接受，且主流觀點認為腫瘤細胞即使在足氧條件下，仍可通過糖酵解方式消耗大量葡萄糖以給腫瘤細胞供能，即瓦氏效應（Warburg effect）[25-26]。而TC 中LncRNA TUG1 是否也可通過調控能量代謝進而影響TC 的生物學行為本研究尚未觸及，是本研究的不足和缺陷，但可將其作為后期研究的一個新的探究方向。

綜上所述，LncRNA TUG1 在TC 中過表達，可能通過促進EMT 的形成進而促進癌細胞的增殖及遷移，可作為一種新的潛在癌基因，靶向抑制LncRNA TUG1 的表達可能是TC 治療的一種新方法，對臨床診治及預測預后具有重要潛在價值。