廣西貴港地區人群MN血型等位基因多態性的調查研究

徐慶萍，王 杰，岑松光，趙衛新，陸 永，黃冬梅，梁延連

(1.貴港市平南縣人民醫院檢驗科，廣西平南 537300； 2.大連醫科大學檢驗醫學系，遼寧大連 116027；3.深圳市血液中心輸血醫學研究所，廣東深圳 518035）

人類MNS 血型系統已被證明了共有46 種抗原,MNS 血型基因結構調控的相關抗原嚴重干擾血型鑒定、臨床輸血與新生兒同種免疫性疾病；同時在器官移植、法醫學鑒定等方面均有著重要的應用價值[1-2]。在亞洲、歐洲、美洲和澳大利亞均有報道由MNS 血型抗體引起的臨床輸血反應，胎兒和新生兒溶血病，在所報道的病例中至少有 40% 的病例報告了嚴重的病情。事實證明，由MNS 血型基因變異所表達的糖蛋白（抗原）在臨床輸血與免疫性疾病中具有重大意義。MNS 血型系統的抗體復雜多樣，對應的臨床有意義的抗體包括：抗-M，抗-N，抗-S，抗-s，抗-“Mia”，抗-Vw，抗-MUT，抗-Hil，抗-TSEN，抗-‘Mi’等。因 此, 研 究MNS 血型等位基因多態性已成為迫切的問題。MN血型抗原的多態性是由編碼血型糖蛋白A(glycoprotein A，GPA)的相關基因GYPA 的第2外顯子決定的，在遺傳過程中發生的堿基突變、交換、錯排、缺失等都會影響MN 抗原的數量或型別的差異。本實驗通過隨機選擇廣西貴港地區人群的300 例全血，以血清學與分子生物學手段來分析本地區人群的MN 血型等位基因的多態性，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象 隨機選取廣西貴港地區300 例無血緣關系的抗凝血,其中男性109 例，女性191 例，采集靜脈血5ml 并用EDTA-K2抗凝。4℃保存，后進行MN 血型鑒定及提取全血DNA。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：單克隆鼠IgM 性質血清Anit-M(批號：20190709)，Anit-N(批號：20190428)均由上海血液生物科技有限責任公司提供；ID-Card（批號：50531.44.21）由BIO-RAD 提供；Gentra DNA 提取試劑盒（批號：106412）由Promega 公司提供。

1.2.2 儀器：Eppendorf9700 PCR 擴增儀與PrismTMABl3730XL 基因測序儀，Embitec 電泳儀及D77WWL-20-M 凝膠成像儀。Diamed-ID 12SI 卡式離心機；Diamed-ID 37SI 孵育器。

1.3 方法

1.3.1 MN 血型血清學劑量效應檢測方法：定量血清與定量紅細胞懸液檢測M 抗原與N 抗原的凝集強度，以判斷MN 抗原在不同個體間的劑量效應，取5μl 紅細胞壓積加入500μl 生理鹽水稀釋成5%的紅細胞懸液，吸取50μl 稀釋5%（v/v）的紅細胞懸液加入ID-Card 微板中，分別加入抗-M 或抗-N血清，放入Diamed-ID 12SI 卡式離心機中以1 030r/min 離心10min 后判讀結果，根據凝集強度判定MN 抗原在不同個體間的表達。

1.3.2 基因頻率計算方法：以m 代表M 基因頻率，n 代表N 基因頻率，根據基因頻率的計算公式：m=M+MN/2，n=N+MN/2計算得到M,N的基因頻率。

1.3.3 DNA 提取與PCR 擴增體系：使用Gentra試劑盒提取300 例廣西貴港地區人群血樣的DNA，并控制DNA的濃度在100ng/μl 左右，以利于后續PCR 擴增。參照深圳市血液中心梁延連[3]設計的引物與擴增條件對貴港地區人群的MN 血型相關基因GYPA 第2 外顯子進行擴增，以直接測序堿基序列的多態性來驗證MN 血型的型別，PCR 擴增引物的正向引物序列為：5’-CCACATAGCAATTCTCTAAAC-3’；反向引物序列為：5’-GCATTTCTCAGTGTTTGTCAC-3’。

1.3.4 PCR 擴增體系與條件：PCR 采用50μl 體系：10×Buffer：5μl；MgCl2：3μl，dNTP 4μl；正，反向引物各2μl；TaqDNA 聚合酶：1μl；DNA 模板：2μl；ddH2O：31μl。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃×1 min，56℃×1 min， 72℃×1 min，30 個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.5 擴增產物驗證： 取3μl 擴增產物經2g/dl 瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段與產物的純度。

1.3.6 擴增產物純化與測序：使用離心過濾柱法(Milliprore 公司)純化擴增產物，以純化后的擴增產物作為測序反應模板，再一次進行擴增，測序引物與第一次擴增引物序列相一致，采用 10μl 反應體系：引物(終濃度為0.0625pmol/L)：3μl；模板DNA：1μl；ddH2O：2.0 μl；ABI Big-Dyev3.1測序反應液4 μl。PCR 擴增條件：94 ℃預變性10min；94 ℃變 性10s，50 ℃退 火5s，60 ℃延 伸4min，運行25 個循環后產物于4℃保存。對以上擴增產物用醋酸鈉/乙醇沉淀法提純后使用PrismTMABl3730XL 基因測序儀檢測，并使用Oli6instatler分析軟件進行分析。

2 結果

2.1 廣西貴港地區人群的MN 血型抗原劑量效應 通過紅細胞與抗體血清定量試驗，發現廣西貴港地區人群的MN 血型抗原在不同個體間存在明顯的劑量效應，即MM 型的紅細胞結合抗-M 抗體的凝集強度達到3+以上，MM 型不同個體間的凝集強度在3+～4+之間；NN 型的紅細胞結合抗-N 抗體的凝集強度也達到3+以上，NN 型不同個體間的凝集強度在2+～4+之間；而MM 型紅細胞結合抗-M 抗體比MN 型紅細胞結合抗-M 抗體的凝集強度要高出2+，同樣的NN 型紅細胞結合抗-N 抗體比MN型紅細胞結合抗-N 抗體也高出2+的凝集強度，說明廣西貴港人群不同個體間的MN 抗原存在明顯的表達差異，這與文獻報道的相一致[4]。

2.2 廣西貴港地區人群MN 血型基因頻率調查結果 見表1。通過MN 血型鑒定，得到本地區的MN 血型基因頻率，與已報道的中國新疆哈薩克族人群基因頻率接近[6]，與西安地區人群[5]、貴州地區布依族人群[7]、廣東省河源地區人群[8]、深圳地區人群[9]等的MN 表型及基因頻率對比，差異均有統計學意義。

表1 廣西貴港地區人群MN 血型基因分布與其他地區人群的比較

2.3 基因測序結果 見表2。經PCR 擴增后，對300 例廣西貴港地區人群血樣進行單特異性堿基序列分析，MN 血型基因特異性關鍵位點在GYPA 基因的第2 外顯子1 號位、22 號位、34，35 號位的堿基區別。

表2 廣西貴港地區人群MN 血型GYPA 基因的第2 外顯子位點區別

從測序結果可清晰的區分MN 雜合子、MM 純合子、NN 純合子血型，基因測序分型與血清學結果完全一致，MN 血型特異性鑒定在GYPA 基因第2 外顯子上的堿基縮略圖見圖1。

圖1MM，MN，NN 基因型測序代表圖（a. MM 純合子表型；b. MN 雜合子表型；c. NN 純合子表型）

通過基因測序GYPA 第2 外顯子的堿基序列，發現所選的廣西貴港地區人群均在第22，34/35位點上區分出MN 血型的特異性，準確地鑒定了MM，MN，NN 基因型，基因分型與血清學檢測結果完全相符。

3 討論

由 GPA 糖蛋白決定的MN 血型系統抗原具有免疫原性，在異型輸血與妊娠后可以產生異源免疫IgG 抗體，引起臨床輸血反應與人類免疫性疾病。MN血型分布具有明顯的地區與人類種族間的差異，在分子水平上，已有研究確定了 GPA 的結構和分子遺傳基礎，同時證明MNS 血型基因家族具有明顯的多樣性模式[10-13]。MNS 血型的高度多態性，主要由高度同源的GYPA，GYPB 和GYPE 基因之間的重組以及單核苷酸變化產生的多態抗原組成,不同地區人群GYPA 基因單核苷酸的變異會構成該區域人群的種族MN 血型基因多態性特征[14]。

決定MN 血型抗原的相關基因GYPA 由7 個外顯子組成，紅細胞膜中成熟的 GPA 僅由GYPA基因外顯子2 ～7 編碼，每個紅細胞中大約表達 2.5×105個GPA 糖 蛋 白[15-17]。區分M，N 抗原的血型糖蛋白在GPA 的第1 位和第5 位氨基酸(M:Ser1/Gly5，N:Leu/Glu5)，兩個氨基酸均位于GYPA 基因的第2 外顯子區間[18]。遺傳過程中GYPA 基因與GYPB 基因同源區域的交叉或轉換會產生不同的混合型糖蛋白基因，這些基因編碼的糖蛋白表現為不同的MNS 變異表型[19]。廣西貴港地區人群的調查研究采用了血型血清學與堿基測序的方法分析了GYPA 的第2 外顯子，并根據GYPA 的第2 外顯子的堿基序列區分出MN 型雜合子，MM型純合子與NN 型純合子。根據貴港地區人群MN血型抗原的定量檢測發現：M 與N 抗原在不同個體中具有明顯的劑量效應，同時發現了廣西貴港地區M 基因頻率明顯偏高，N 基因頻率相對較低的分布特征，這與中國新疆哈薩克族人群的MN 血型基因頻率接近[6]，與西安地區人群、貴州地區的布依族人群、廣東河源地區人群、廣東深圳地區人群的MN 型基因頻率均有差異[5,7-9]。這說明：MN 血型存在地區的多態性特征，如果廣西貴港地區的患者血漿中存在抗-M 不規則抗體時，較難篩檢到M 抗原陰性的血液，因為NN 型純合子的頻率只有13%，這將給臨床輸血帶來一定的困擾，以上結論是本研究的應用價值及推廣性。隨機選擇廣西貴港地區的300 例人群從基因測序結果證實了GYPA 基因第2 外顯子堿基序列的鑒定結果與抗-M，抗-N抗體血清檢測分型一致，而且未發現GYPA 的第2外顯子中存在特異性突變，其他外顯子的堿基是否有異常表達有待進一步的研究。

綜上，通過對廣西貴港地區人群MN 血型基因頻率的調查分析和GYPA 第2 外顯子結構特征的了解，明確了廣西貴港地區人群的MN 基因多態性，為臨床輸血前MN 同型輸血的儲備用血做好鋪墊，為廣西貴港地區的器官移植、新生兒免疫性溶血性疾病的診斷、法醫學鑒定以及群體遺傳關系和種族遷移等領域的研究奠定了基礎。基于MN 血型的地域性特征比較明顯，可能還有相關基因的堿基突變未被發現，有待增加標本量對廣西貴港地區人群的MN 血型進行深入與更廣泛的研究。