血清外泌體miR-221和miR-378水平檢測(cè)在胃癌診斷中的應(yīng)用研究

張?bào)銝|，謝星星，李 佳，朱 帥

（1. 延安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西延安 716000；2. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安 716000）

胃癌(gastric cancer)在我國(guó)是發(fā)病率很高的一種惡性腫瘤，其死亡率根據(jù)近年統(tǒng)計(jì)占我國(guó)城鄉(xiāng)人口癌癥死因之第二位[1]。目前胃癌的早期診斷率比較低，多數(shù)患者在就診時(shí)已經(jīng)到了癌癥中晚期或晚期。因此，尋找靈敏度和特異度比較高的胃癌腫瘤標(biāo)志物，從而提高胃癌的早期診斷率非常有必要。微RNA 或microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度為21～23 個(gè)堿基的非編碼小RNA 分子，他們的表達(dá)水平在多種癌癥出現(xiàn)異常，并在不同腫瘤中呈差異表達(dá)，miRNA 目前被認(rèn)為是可用于診斷惡性腫瘤的一種比較好的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的miRNA miR-221 和miR-378 表達(dá)水平均升高，對(duì)胃癌具有潛在診斷意義[2]。外泌體（exosome）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種大小為30～150 nm 的微囊泡，由細(xì)胞分泌并在血液中循環(huán)，囊泡中攜帶著多種生物信息分子，如mRNA，miRNA，linRNA 和DNA片段等，這些信息分子往往與癌癥發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，通過檢測(cè)外泌體內(nèi)容物中的特定信息分子對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行輔助診斷，在最近幾年備受重視[3]。本文研究了血清外泌體中miR-221 和miR-378 的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷胃癌的應(yīng)用價(jià)值，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月～2020年1月在延安市人民醫(yī)院就診且經(jīng)病理檢查確診的胃癌患者92 例為胃癌組，其中男性53 例，女性39 例，年齡46～81 歲。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)盟委員會(huì)第7 版胃癌腫瘤TNM 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中I 期16 例，II 期21 例，III 期45 例，IV 期10 例。按分化程度分，分為低分化65 例，中、高分化27 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)過胃鏡檢查和活檢確診為胃癌，患者同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)有其他腫瘤，自身免疫性疾病/血液疾病，并發(fā)感染性疾病如肝炎、結(jié)核等，臨床資料不完整。選擇同期在我院診斷為胃息肉的患者68 例為胃息肉對(duì)照組，男性40 例，女性28 例，年齡46～81 歲。選擇同期我院健康體檢者50 例為健康對(duì)照組，男性29 例，女性21 例，年齡46～81 歲。以上三組的年齡和性別等一般資料匹配。

1.2 儀器與試劑 血清外泌體的提取采用日本SBI公司ExoQuick-TM 外泌體提取試劑，血清外泌體顆粒濃度用英國(guó)Malvern 公司Nanosight 試劑檢測(cè)，Western Blot 檢測(cè)用的兔抗calnexin，CD9，CD63和TSG101 蛋白一抗購(gòu)自Abcam 上海貿(mào)易有限公司，羊抗兔二抗購(gòu)自碧云天杭州生物科技有限公司，RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄和定量測(cè)定分析用德國(guó)QIAGEN 公司的mirVana 試劑盒。

1.3 研究方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集：患者于確診入院后2 周內(nèi)進(jìn)行采血，清晨空腹取靜脈血10 ml，4℃靜置30 min，1 800 r/min 離心20 min，棄上清，置-80℃冰箱保存。

1.3.2 外泌體提取鑒定：血清外泌體的提取嚴(yán)格按照SBI 公司ExoQuick-TM 外泌體提取試劑盒的說明進(jìn)行操作。外泌體鑒定用Western Blot 檢測(cè)外泌體表面4 種蛋白標(biāo)志物（calnexin，CD9，CD63 和TSG101 蛋白）的表達(dá)水平。血清外泌體顆粒濃度檢測(cè)用Nanosight 法，將樣品稀釋50 00～20 000 倍，使樣品中顆粒濃度為107/ml～109/ml，Nanosight 檢測(cè)參數(shù)不變、閾值設(shè)定為5。

1.3.3 外泌體miRNA 定量測(cè)定：外泌體中miRNA的定量測(cè)定，先用RNA 提取試劑提取外泌體總RNA，再用mirVana 試劑以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）對(duì)miRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量測(cè)定分析。按照miR-221 和miR-378 在GeneBank 中的序列號(hào)，用Premier Primer 5.0 軟件進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)。RTqPCR 的總反應(yīng)體系為25 μl，預(yù)變性95℃ 10 min，反應(yīng)條件95℃ 5s，60℃ 60s，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。用ABI7700 軟件采集熒光信號(hào)做溶解曲線分析，每樣品3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行絕對(duì)定量測(cè)定分析。用化學(xué)合成的1 mol/L miRNA，稀釋成不同濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品（106, 105, 104, 103, 102fmol/L），以每個(gè)濃度的對(duì)數(shù)值為X 軸，以每個(gè)濃度相對(duì)應(yīng)的Ct 值為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)所測(cè)得的Ct 值計(jì)算miR-221 和miR-378 的絕對(duì)濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22. 0 統(tǒng)計(jì)軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），在此之后用LSD 做兩兩比較分析，用ROC 曲線評(píng)估m(xù)iR-221 和miR-378聯(lián)合檢驗(yàn)在胃癌診斷中的效能，率的比較用卡方檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定 血清外泌體標(biāo)本經(jīng)Western Blot分析鑒定，結(jié)果顯示，來自胃癌組、胃息肉組和健康組的血清外泌體標(biāo)本的Calnexin，CD63，CD93和TSG101 這4 種外泌體標(biāo)志蛋白均呈高表達(dá)，而來自相應(yīng)組細(xì)胞裂解物的這4 種標(biāo)志性蛋白均呈低表達(dá)。Nanosight 顆粒濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，標(biāo)本中含有大量的直徑為30～100 nm 的細(xì)胞外微囊泡顆粒。故認(rèn)為所獲得的血清外泌體標(biāo)本中確實(shí)含有外泌體。

2.2 外泌體miR-221 和miR-378 定量檢測(cè) 見表1。血清外泌體標(biāo)本中miR-221 和miR-378 水平用RTqPCR 進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)ANOVA 分析發(fā)現(xiàn)各組均數(shù)之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。進(jìn)一步用LSD 做兩兩比較分析，結(jié)果顯示，血清外泌體miR-221 和miR-378 水平在胃癌組和健康對(duì)照組(F=10.986，10.721)之間、在胃癌組和胃息肉組(F=7.112，7.238)之間以及在胃息肉組和健康對(duì)照組(F=3.863,3.579)之間差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.01)，胃癌組高于健康對(duì)照組并高于胃息肉組、胃息肉組高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。

表1 三組間血清外泌體miR-221 和miR-378水平（±s）比較

檢測(cè)項(xiàng)目(fmol/L)胃癌組（n=92）胃息肉組（n=68）健康組（n=50） P miR-221 197.62±27.88 114.70±20.54 54.49±13.75 ＜0.01 miR-378 189.44±25.36 101.39±17.28 47.65±13.09 ＜0.01

2.3 外泌體miR-221 與miR-378 聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能評(píng)價(jià) 見表2 和表3。用ROC 曲線分析比較外泌體miR-221 與miR-378 單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌組和健康對(duì)照組診斷效能的數(shù)據(jù)顯示，miR-221的曲線下面積為0.689，miR-378 的曲線下面積為0.657，聯(lián)合檢測(cè)miR-221 和miR-378 的曲線下面積為0.776，聯(lián)合檢測(cè)的特異度、靈敏度、診斷符合率以及陰性預(yù)測(cè)值均明顯高于單獨(dú)檢測(cè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。用ROC 曲線下面積分析比較miR-221 與miR-378 單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌組和胃息肉組診斷效能的數(shù)據(jù)顯示，miR-221 的曲線下面積為0.681，miR-378 的曲線下面積為0.672，聯(lián)合檢測(cè)miR-221 和miR-378 的曲線下面積為0.755，聯(lián)合檢測(cè)的特異度、靈敏度、診斷符合率以及陰性預(yù)測(cè)值都明顯高于單獨(dú)檢測(cè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。以上結(jié)果說明，外泌體miR-221 與miR-378 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷價(jià)值高于單獨(dú)檢測(cè)。

表3 外泌體miR-221 與miR-378 單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌組和胃息肉組診斷效能的ROC 曲線分析

3 討論

外泌體是細(xì)胞形成和分泌的一種具有脂質(zhì)雙層的膜性微囊泡，囊泡中包含有多種類型的小分子RNA，DNA 片段和蛋白質(zhì)等生物信息分子。外泌體的直徑介于30～100 nm，密度為1.11～1.19 g/ml[3]。幾乎所有類型的細(xì)胞在正常和病理情況下均能形成和分泌外泌體，其形成過程包括細(xì)胞內(nèi)內(nèi)體顆粒的膜內(nèi)陷形成多囊泡體，多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后其中的囊泡被釋放到胞外即為外泌體。外泌體廣泛存在于血液循環(huán)、唾液、尿液、羊水和母乳中，在細(xì)胞間交流或信息傳遞、細(xì)胞增殖分化和免疫調(diào)節(jié)等多種過程中發(fā)揮重要的作用，并參與了心血管、消化、神經(jīng)、免疫等疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，檢測(cè)外泌體及其成分有望成為一種新的疾病診斷方法或輔助診斷方法[4]。

為保證外泌體和其他細(xì)胞外微囊泡研究的可信度與重復(fù)性，國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)制定了最低要求的國(guó)際研究指南。外泌體的鑒定主要包括形態(tài)學(xué)特征、濃度和/或直徑大小、表面蛋白分子鑒定等[5-6]。我們的研究中，外泌體鑒定用Western Blot 檢測(cè)了外泌體表面4 種蛋白標(biāo)志物（calnexin，CD9，CD63 和TSG101 蛋白）的表達(dá)水平，用Nanosight 法檢測(cè)了外泌體的顆粒濃度，所用的方法和指標(biāo)數(shù)均符合國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)的要求。

基于外泌體檢測(cè)的臨床診斷大多聚焦于外泌體內(nèi)容物的檢測(cè)。外泌體核酸內(nèi)容物的檢測(cè)研究，多采用二代測(cè)序技術(shù)、雜交芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）或液滴數(shù)字PCR 技術(shù)[5-6]。我們的研究，用RTqPCR 技術(shù)定量檢測(cè)了來自胃癌患者、胃息肉患者和健康體檢者的血清外泌體標(biāo)本中的兩種microRNA，miR-221 和miR-378 的水平。

MicroRNA 是一類由細(xì)胞基因組編碼的長(zhǎng)度約為22bp 的非編碼單鏈小RNA 分子，廣泛存在于各種真核生物，參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。迄今，已經(jīng)報(bào)道了約3 萬種miRNA 分子在不同動(dòng)植物中存在，在人類中，已發(fā)現(xiàn)的約有2 600 種。在病理方面，miRNA 可以參與調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達(dá)，因而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。miRNA 在多種腫瘤患者的血清/血漿和組織液中以非常穩(wěn)定的形式存在，被認(rèn)為是一種新的實(shí)用的腫瘤生物標(biāo)志物，在多種腫瘤包括胃癌的診斷方面有很好的應(yīng)用前景。

在我國(guó)已有不少關(guān)于胃癌miRNA 研究的報(bào)道[7-9]。LIU 等[10]用全基因組miRNA 微陣列技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血漿中miR-378，miR-371-5p 和miR-187 表達(dá)水平升高，其中miR-378 在胃癌早期即表達(dá)升高。SONG 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血漿miR-221，miR-744 以及miR-376c 的表達(dá)水平升高。ZHANG 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-214 的表達(dá)在胃癌組織和患者血漿中均顯著升高，其血漿水平在患者術(shù)后從第14 天至第30 天呈進(jìn)行性下降。LI等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-17-92 在胃癌患者中的表達(dá)上調(diào)。因此，以上miRNA 均可作為胃癌輔助性診斷的生物標(biāo)志，聯(lián)合檢測(cè)則更有意義[14-16]。我們選擇了miR-221 和miR-378，研究了血清外泌體中這兩種miRNA 聯(lián)合檢測(cè)用于診斷胃癌的價(jià)值，結(jié)果顯示，血清外泌體miR-221 和miR-378 水平聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷胃癌有一定的應(yīng)用價(jià)值。