誘導痰Galectin-3BP及相關炎癥因子水平檢測在中性粒細胞型哮喘診斷中的價值

劉 敏，李承紅，劉 雙，王小江，鐘金男，石 奕

（江漢大學附屬醫院武漢市第六醫院呼吸內科，武漢 430015）

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是多種炎性細胞和炎性介質參與的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘的異質性決定哮喘個體間存在不同的氣道炎癥表型。目前嗜酸粒細胞型哮喘（eosinophilic asthma，EA）得到了廣泛的研究。近來研究表明高達50%的哮喘患者為中性粒細胞型哮喘( neutrophilic asthma，NA)，對激素治療反應差[1]。半乳糖凝集素-3 結合蛋白（galectin-3BP）參與調節細胞黏附、凋亡、炎性反應、腫瘤轉移等許多生理病理過程[2]。近年來有證據顯示Galectin-3BP 在哮喘的發病機制中發揮重要作用，但在NA 中的作用尚未見報道[3]。誘導痰較外周血能更好地反映氣道炎癥的本質，本研究擬通過觀察NA 患者誘導痰Galectin-3BP 及相關炎癥因子表達水平，探討其在NA 診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年10月～2019年6月江漢大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科收治的65例哮喘患者為研究對象。據誘導痰嗜酸粒細胞和中性粒細胞的百分比予以分組，分為EA 組（嗜酸粒細胞≥3%且中性粒細胞＜ 61%）和NA 組（中性粒細胞≥61%且嗜酸粒細胞＜3%）[5]。EA 組38 例，男性16 例，女性22 例，平均年齡41.41 ± 9.26 歲。NA 組27 例，男性11 例，女性16 例，平均年齡43.38 ± 11.53 歲。哮喘診斷符合我國支氣管哮喘防治指南哮喘的診斷標準[4]。排除標準：①哮喘急性加重期，近4 周曾全身使用糖皮質激素或吸入糖皮質激素，3 天內使用抗過敏藥、茶堿等藥物者；②合并慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張、肺炎、肺結核等其它呼吸系統疾病者；③并發淋巴瘤、白血病、惡性腫瘤、嗜酸粒細胞增高癥等疾病者；④并發嚴重心血管疾病及肝腎功能不全者；⑤患有精神疾病、妊娠及哺乳期婦女；⑥未能完成誘導痰檢查或誘導痰標本不合格者。所有受試者均獲得知情同意。

1.2 試劑和方法

1.2.1 痰液的采集、處理：痰液的采集、質控參照中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組咳嗽的診斷與治療指南（2015）中高滲鹽水霧化誘導痰炎癥細胞檢測方法[6]。將收集的痰標本用0.1g/dl 二硫蘇糖醇(DTT)溶液裂解后過濾、離心，重懸沉淀細胞，細胞懸液予以瑞士染色，光鏡下分類計數 400 個有核細胞，分別計算嗜酸粒細胞（EOS）、中性粒細胞（PMN）、巨噬細胞（M?）和淋巴細胞（LYM）百分比。留取上清液于-80℃冰箱用于炎癥因子的檢測。

1.2.2 誘導痰Galectin-3BP 與IL-1β，IL-6 和IL-8水平測定：采用ELISA 法檢測誘導痰上清液中Galectin-3BP，IL-1β，IL-6 和IL-8 水平。Galectin-3BP 試劑盒購自美國ebioscience 公司，IL-1β，IL-6 和IL-8 試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司，操作過程嚴格按照相關試劑盒說明書。

1.3 統計學分析 用 SPSS 18.0 軟件進行統計處理，正態分布的計量資料以均值±標準差（±s）表示， 兩組間比較采用兩獨立樣本的t 檢驗。計數資料采用n（%）表示，率的比較采用 χ2檢驗。非正態分布計量資料以中位數（四分位數間距）[M（P25～P75)]表示，兩組間比較采用wilcoxon 秩和檢驗。相關性用Pearson 進行相關性分析。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組哮喘患者誘導痰Galectin-3BP，炎癥因子及炎癥細胞的比較 見表1。與EA 組相比，NA 組誘導痰Galectin-3BP 明顯升高，差異有統計學意義(P＜ 0.05)；NA 組 誘導痰IL-1β，IL-6，IL-8 明 顯高于EA 組，差異有統計學意義(均P＜0.05)；NA組誘導痰PMN，M? 計數明顯高于EA 組，差異有統計學意義(均P ＜0.05)；兩組患者LYM 計數差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表1 兩組患者誘導痰Galect-3BP，炎癥因子及炎癥細胞的比較[±s，M(P25～P75)]

表1 兩組患者誘導痰Galect-3BP，炎癥因子及炎癥細胞的比較[±s，M(P25～P75)]

指標 NA(n=27) EA(n=38) t/Z 值 P Galect-3BP (ng/ml) 102.86 ±24.08 64.02 ±18.93 47.314 0.006 IL-1β (ng/ml) 998.03±30.67 97.84 ± 20.59 87.261 ＜0.001 IL-6 (ng/ml) 958.82 ± 38.08 506.09 ±32.41 34.210 0.017 IL-8 (ng/ml) 75.92 ± 14.37 11.46 ± 8.02 52.305 0.003 EOS（%） 0.38(0.14～0.53) 4.68(3.12～12.83) 82.904 ＜0.001 PMN（%） 81.52(70.03～93.84) 24.86(14.35～36.79) 94.035 ＜0.001 M?（%） 52.14(38.01～74.52) 25.06((6.58～29.37) 38.603 0.014 LYM（%） 0.37(0.24～1.33) 0.52(0.22～1.68) 9.016 0.068

2.2 誘導痰Galectin-3BP 與炎癥因子及炎癥細胞的相關性分析 誘導痰Galectin-3BP 與IL-1β，IL-6，IL-8 呈正相關（r =0.670, P＜0.001; r =0.632, P＜0.001;r =0.651, P＜0.001），與PMN，M?，LYM呈正相關（r=0.475, P= 0.018; r =0.461, P=0.026; r= 0.454, P=0.031），與EOS 無明顯相關性(r=-0.219, P=0.069)。

3 討論

NA 是按哮喘氣道炎癥表型分類的一種哮喘亞型，目前將誘導痰中性粒細胞計數持續（至少有2次）占非鱗狀細胞總數的61%～76%，或絕對計數大于5.0×106/ml 的哮喘定義為NA[7]。NA 患者存在更明顯的氣流受限及氣道重塑，在臨床上往往是重癥哮喘、難治性哮喘，與激素抵抗密切相關，近年來已成為學術界關注的焦點[8-9]。Galectin-3BP 又稱為Mac-2 結合蛋白（M2BP）或90K 糖蛋白，是一種細胞外基質分泌的糖基化蛋白，屬于巨噬細胞清道夫受體（scavenger receptor，SR）富含半胱氨酸域超家族之一，最早在人乳腺癌細胞培養液中發現。Galectin-3BP 可促進腫瘤的發生、發展、分化及轉移，為腫瘤預后的生物標志物之一[2]。近年來，Galectin-3BP 在病毒感染、纖維化、靜脈血栓形成、自身免疫性肝病、慢性胰腺炎、支氣管哮喘等炎癥和炎癥相關性疾病中的作用逐漸被揭示[10-13]。

KALAYCI 等[3]研究發現哮喘患者外周血和肺泡灌洗液（BALF）中Galectin-3BP 明顯高于健康對照組，且與外周血嗜酸性粒細胞數呈負相關，進一步將Galectin-3BP 與外周血單個核細胞（PBMC）共培養，發現Galectin-3BP 可以誘導PBMC 分泌IL-6，抑制IL-4，IL-5，IL-13 等Th2 相關炎性因子的轉錄。本研究結果顯示與EA 組相比，NA 組誘導痰Galectin-3BP 顯著升高，且與PMN 計數及IL-1β，IL-6，IL-8 水平均呈正相關。而IL-1β，IL-6和IL-8 具有募集、活化中性粒細胞，促進中性粒細胞與炎癥部位結合的生物學功能。以上研究結果提示Galectin-3BP 促進中性粒細胞性氣道炎癥，抑制Th2 介導的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥。

Galectin-3BP 可能通過下列機制參與哮喘中性粒細胞性氣道炎癥：①通過趨化因子和黏附分子誘導中性粒細胞的募集。研究表明Galectin-3BP可以誘導MCP-1 等趨化因子和ICAM-1，VCAM-1，E-seletin 等黏附分子的表達，從而介導炎癥細胞向炎癥部位的遷移[14]。②通過激活單核巨噬細胞分泌大量炎癥因子從而有效動員、募集和活化中性粒細胞，加重氣道炎癥。研究表明Galectin-3BP 與人單核細胞系THP-1 和單核細胞來源的巨噬細胞共培養，可以誘導細胞合成和分泌IL-6，IL-8，TNF-α 等炎性因子，且對炎癥的調控呈現出時間和濃度依賴性[14-15]。③通過活化T 細胞介導獲得性免疫反應參與哮喘氣道炎癥。POWELL等[16]發現Galectin-3BP 可以刺激PBMC 誘導T細胞分泌IL-1，IL-6，GM-CSF 和TNF-α 等 炎性因子，但將Galectin-3BP 單獨與T 細胞共培養則無法誘導T 細胞產生炎性因子。因此Galectin-3BP 可能通過作用于單核巨噬細胞或其它效應細胞產生效應分子作為共刺激信號激活T 細胞參與氣道炎癥反應。目前Galectin-3BP 在哮喘發病機制中的作用尚不完全清楚。Galectin-3BP 廣泛分布于人體體液和組織器官中，在巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞等多種氣道炎癥細胞中均有表達，其蛋白結構域的復雜性和配體的多樣性可能介導多種不同的生物學效應，關于Galectin-3BP 介導中性粒細胞性氣道炎癥的具體機制仍有待于進一步研究及證實。

綜上所述，誘導痰Galectin-3BP 及相關炎癥因子水平檢測有助于氣道炎癥表型的預測，可作為NA 的生物標志物，對哮喘的分型診斷、療效觀察、治療方案調整和預后判斷等具有一定的指導意義。