Aurora-B激酶的表達與非小細胞肺癌患者預(yù)后及耐藥的相關(guān)性分析

席俊峰，彭彥才，馬興聰，郝光軍

（1.榆林市第一醫(yī)院a.胸心外科；b 腫瘤科；陜西榆林 719000；2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤病院 ,西安 710004）

在我國，肺癌作為發(fā)病率和死亡率均位居首位的惡性腫瘤，嚴重影響患者的生命健康[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的類型，約占肺癌的85%。NSCLC 患者的5年生存率僅為15%[2-4]。目前臨床上NSCLC 治療方法主要有化療、放療、手術(shù)、分子靶向治療和免疫治療，但是由于耐藥性和以上方法導(dǎo)致的毒副反應(yīng)時常影響臨床療效和患者的預(yù)后。

近年來有研究表明，Aurora-B 激酶對乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等惡性腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生具有重要調(diào)控作用[5-8]，但其在肺癌中的作用鮮有報道。本研究主要目的是通過對臨床NSCLC組織的檢測，探究Aurora-B 激酶在NSCLC 組織中的表達情況及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，為發(fā)現(xiàn)NSCLC 新的分子治療靶點提供理論依據(jù)，另外通過細胞培養(yǎng)方法分析Aurora-B 激酶的表達與腫瘤細胞耐藥性的關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究選取2006年2月～2012年11月榆林市第一醫(yī)院收治并術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為NSCLC 的194 例患者為研究對象，年齡37～72 歲，中位年齡56 歲。患者均在簽署知情同意書后獲取其臨床樣本、病案信息以及遠期臨床隨訪資料。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 Aurora-B 抗體(美國LSBIO 公司)；紫杉醇(四川協(xié)力制藥有限公司)；順鉑(德州德藥制藥有限公司)；DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；光學顯微鏡(日本Olymps 公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測：Aurora-B 激酶的表達:應(yīng)用常規(guī)方法進行病理組織脫蠟和水化后，用3%(體積分數(shù))的過氧化氫溶液在室溫下處理組織樣本10 min，然后用PBS 漂洗病理組織樣本，將樣本浸入枸櫞酸鈉溶液，水浴中加熱至95℃～100℃20 min。PBS 漂洗3 次，5 min/次。加入10g/ml 山羊血清孵育30 min。最后加入稀釋200×兔抗人Aurora-B 抗體，37℃孵育2 h。PBS漂洗后加入二抗37℃孵育15 min。再次PBS 漂洗后加入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育15 min。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明， 封片。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判斷標準：在光學顯微鏡下用高倍鏡(×400)進行觀察，隨機選取每張切片中的5 個視野，并且每個視野計數(shù)200 個細胞。通過觀察NSCLC 細胞核的染色情況評估Aurora-B 激酶表達。染色陽性的判斷標準：NSCLC 細胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰黃色或棕黃色顆粒。每張切片均由兩名具有10年以上病理科工作經(jīng)驗的執(zhí)業(yè)醫(yī)師在雙盲條件下獨立閱讀，評估結(jié)果不一致時重新閱片并協(xié)商以確定結(jié)果。本次研究中兩位讀片人讀片結(jié)果一致率為96.39%。

1.3.3 耐藥性誘導(dǎo)實驗：本研究主要針對NSCLC治療中的兩種常用藥物，紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和順鉑(Cisplatin，CDDP)進行耐藥性誘導(dǎo)實驗。隨機選取60 例NSCLC 患者的腫瘤組織約1.0cm3大小盡量剔除纖維組織及黑色顆粒，立即浸入無菌培養(yǎng)瓶中，并于10 min 內(nèi)轉(zhuǎn)運至實驗室。在超凈臺上，用無菌PBS 液沖洗2 次，無菌切除組織包膜，結(jié)締組織與壞死組織，剪成盡可能小的組織碎塊，大小約1mm3。將組織小塊置于0.25g/dl 胰酶40ml中，裝入培養(yǎng)瓶，置于37℃水浴箱中30 min，使其充分消化，期間在鏡下觀察，當細胞變圓接近脫壁時，棄消化液，用10 ml 完全-1640 終止消化。用200 目篩網(wǎng)將消化后的細胞懸液過濾收集，用無菌PBS 液洗滌2 次(離心，1 500 r/min)，懸于20ml 完全-1640 中，鏡下觀察細胞。于無菌離心管中依次輕輕加入100%及60%的淋巴細胞分離液各10ml，其上再沿管壁輕輕加入細胞懸液(離心，2 000 r/min，20min)，收集60%分離液界面上的細胞，加5 倍無菌PBS 液，2 000r/min 離心20 min，去上清，加15 ml 無菌PBS 液，離心前進行細胞計數(shù)，再次離心，2 000r/min，20min，去上清，調(diào)整細胞濃度為 1×105/ml～2×105/ml。后經(jīng)免疫組化染色確認，其中Aurora-B 激酶表達陽性患者41 例，Aurora-B 激酶表達陰性患者19 例。

首先將1×104個腫瘤細胞置于96 孔板中吸附6 h，然后加入濃度梯度依次為0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μmol/L 的PTX 和CDDP，孵育72 h。MTT 實驗法測定細胞增殖并計算IC50 值。耐藥性誘導(dǎo)實驗以IC50 值為誘導(dǎo)濃度，在細胞中加入濃度梯度(0～100μmol/L)的PTX 和CDDP 后孵育72 h，通過MTT 實驗法確定耐藥性引導(dǎo)后的IC50 值。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗分析分類資料組間差異，定量資料采用兩獨立樣本t 檢驗比較組間差異。采用Log-Rank 檢驗比較患者生存時間的組間差異并繪制K-M 生存曲線。應(yīng)用COX 模型分析影響患者預(yù)后的因素。本研究中I 類錯誤控制水平α 取值為0.05，P＜0.05 時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Aurora-B 激酶的表達與NSCLC 患者臨床病理特征的相關(guān)性 見圖1 A～D 。Aurora-B 激酶表達于NSCLC 細胞核中，陽性顆粒染色清晰、對比度強且陽性細胞核較大，見表1。Aurora-B 激酶的表達與NSCLC 患者的組織類型和臨床分期顯著相關(guān)，并且其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 Aurora-B 蛋白在非小細胞肺癌組織中表達情況

表1 Aurora-B 激酶表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 Aurora-B 激酶的表達與NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系 見圖2。Log-Rank 檢驗結(jié)果提示Aurora-B 激酶陽性患者較Aurora-B 激酶陰性患者的總體生存率縮短，并且其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.000 1)。

應(yīng)用COX 回歸模型對NSCLC 患者的生存時間進行單因素分析，結(jié)果見表2。Aurora-B激酶表達、病理組織類型和臨床分期是NSCLC 患者生存時間的影響因素。多因素分析結(jié)果見表3。Aurora-B 激酶表達、病理組織類型和臨床分期均可顯著影響NSCLC 患者的生存時間。其差異均具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。

圖2 不同Aurora-B 激酶表達情況患者K-M 生存曲線

2.3 非小細胞肺癌患者Aurora-B 激酶與腫瘤細胞耐藥的相關(guān)性 見圖2。Aurora-B 激酶陽性的NSCLC 患者經(jīng)CDDP 和PTX 耐藥性誘導(dǎo)后IC50值顯著升高，并且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.000 1)。

3 討論

Aurora 激酶家族都有相似的催化結(jié)構(gòu)區(qū)域[9]，主要由較短的C 末端尾部及長度可以不斷變化的N 末端防守側(cè)翼。Aurora-B 激酶可于著絲粒內(nèi)蛋白(inner centromere protein，INCENP) 和 存 活 素(survivin)共同組成染色體過客蛋白，并在中心體成熟、分裂、紡錘體組裝和穩(wěn)定等細胞生理過程中起重要作用。染色體過客蛋白在細胞分裂早期隨染色體定位，在中期向內(nèi)部著絲粒區(qū)域聚集，后期則離開染色體并移動至中心紡錘體。整個過程要求染色體過客蛋白的各組成部分有準確的定位，一旦任何組成成員缺失或者Aurora-B 激酶活性不足都能造成定位錯誤和整體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[10]，最終導(dǎo)致細胞分離異常。

表2 NSCLC 患者生存時間的單因素分析

表3 NSCLC 患者生存時間的多因素分析

表4 NSCLC 患者Aurora-B 激酶表達與耐藥的相關(guān)性

已有研究證實Aurora-A 激酶與人多種實體瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而關(guān)于Aurora-B 激酶的研究較少。有研究顯示，Aurora-B 激酶在膠質(zhì)瘤細胞、胃癌細胞、宮頸癌細胞中存在高表達，并且腫瘤細胞染色體出現(xiàn)成倍增長[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌細胞中Aurora-B 激酶存在過表達情況，并且Aurora-B 激酶異常表達與患者的預(yù)后顯著相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示Aurora-B 激酶表達陽性是患者預(yù)后的重要影響因素。

本次研究還對Aurora-B 激酶與CDDP 和PTX耐藥間的關(guān)系進行了研究。研究結(jié)果提示Aurora-B的過度表達與腫瘤細胞對CDDP 及PTX 的耐藥存在相關(guān)關(guān)系，此研究結(jié)論與其他實體瘤化療耐藥性研究如卵巢漿液性癌，乳腺癌中所發(fā)現(xiàn)Aurora-B與化療藥物耐藥性存在相關(guān)性的結(jié)論一致。在正常情況下，細胞分裂的過程會觸發(fā)p53 的活化以及下游修復(fù)和凋亡通路，清除處于異常增殖狀態(tài)的細胞。然而，在Aurora-B 過表達的情況下，p53 的大部分受到泛素介導(dǎo)的蛋白降解，這進一步降低了p21 和BAX 的表達[14]。BAX 是一種促凋亡因子，p21 是DNA 損傷的應(yīng)答物，通過在G1/S 期阻滯細胞周期，激活細胞凋亡[15-16]。p21 和BAX 的缺失使DNA 損傷和染色體數(shù)目異常的細胞繞過增殖異常細胞檢查及清除過程，避開損傷修復(fù)，最終影響針對癌細胞DNA 和細胞周期的藥物療效，導(dǎo)致耐藥[16]。

綜上，本研究結(jié)果表明，Aurora-B 激酶的過度表達與非小細胞肺癌的病理生理過程密切相關(guān)，Aurora-B 激酶可能參與了非小細胞肺癌的發(fā)生及惡性進展，與患者不良預(yù)后及耐藥相關(guān)。以上結(jié)論提示Aurora-B 可能是非小細胞肺癌的新標志物及潛在治療靶點。后續(xù)我們擬從RNA 水平驗證上述結(jié)論，并利用細胞學、分子生物學及形態(tài)學等研究方法進一步探究Aurora-B 激酶對腫瘤生物學行為的影響及其作用機制。