急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者血清miR-186-5p，miR-23和miR-652水平檢測的臨床意義

趙 莉，白延平，謝園媛（延安大學附屬醫院，陜西延安 716000）

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)，是中老年常見的后天性心臟病，其發病率在各類心臟疾病中居首位[1]。急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)是IHD 的主要表現形式，是非常嚴重的醫學急癥，主要是由冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定所導致的心肌缺血，其臨床表現包括急性心肌梗死(acute myocardium infarction，AMI)和不穩定心絞痛(unstable angina pectoris, UAP)。ACS 的診斷目前主要基于臨床癥狀、心電圖或侵入性血管造影。然而，這些檢測易受臨床主觀性影響，而且血管造影有可能產生一些并發癥。血肌鈣蛋白I （cardiac troponin I, cTnI）為心肌損傷壞死標記物[2]，常被用于ACS 的檢測，但是cTnI 在早期階段豐度較低、特異性差。因此，急需尋找新的生物標志物來診斷ACS。

微小RNAs(miRNAs)是一種小的(18～24 個核苷酸)非編碼RNA 分子，在機體內調控相關基因表達，參與各種生理過程的發展[3]。miRNAs 存在于多種生物液體中，如血清、尿液和唾液等，檢測手段簡單，并能夠顯示出器官特異性 (如肝臟中的miR-122 和心臟中的miR-499)[4]。目前已有多項研究證實miRNAs 在ACS 診斷中具有重要作用[5]。比如，miR-186-5p 在診斷ACS 方面具有良好的性能[6]；miR-23b 是ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）早期的生物標志物[7]；miR-652 的ACS 預后價值優于左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）和氨基腦鈉肽前體（N-terminal-pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）[8]。基于這些發現，本文評估了miR-186-5p，miR-23b, miR-652聯合使用在ACS 患者中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016～2018年在延安大學附屬醫院收治并確診為ACS 的患者68 例，另外選取同期做冠脈造影符合冠心病診斷，但排除ACS 的患者68 例作為對照組。所有ACS 患者均首次接受經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）。納入標準：符合歐洲心臟病協會（ESC）和美國心臟病學會（ACC）制定的診斷標準，并經冠狀動脈造影檢查確診。排除標準：有冠狀動脈旁路移植術史、心源性休克、卒中、惡性疾病及各種急慢性感染性疾病的患者。根據上述診斷將ACS 分為2 個亞組：急性心肌梗死（AMI）組（n=52）和不穩定性心絞痛（UAP）組 (n=16)；平均年齡59.25±11.22 歲；男性38 例，女性30 例。對照組平均年齡為58.34±9.32 歲；男性35 例，女性33 例。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本項研究得到延安大學附屬醫院倫理委員會的批準（批準文號：2015-YAFVD-017），患者及家屬均知情同意。

1.2 儀器與試劑 ADVIA CENTAUR XP 全自動化學發光免疫分析儀檢測cTnI 水平；RNA 提取和qRT-PCR 試劑盒用于檢測miRNAs 水平。

1.3 方法

1.3.1 檢測外周血中的cTnI 水平：收集ACS 患者入院時(PCI 術前)及PCI 術后7 天時的外周靜脈血5 ml。同時外收集對照組血樣，所有樣品立即以3 000 r/min 離心5 min ；取上清置于-80 ℃保存待測。實驗步驟按照說明書進行。

1.3.2 PCI 治療：由兩名或兩名以上經驗豐富的醫生根據標準指南進行PCI 介入治療。當梗死相關動脈狹窄度≥70%時置入支架，同時由手術人員對病變動脈的類型、數量和狹窄程度進行視覺采集。經皮冠狀動脈介入治療后，殘余狹窄≤20%，心肌梗死相關動脈中至少有兩處出現溶栓血流分級。在進行導管插入術前，患者口服300 mg 阿司匹林（拜阿司匹林）、600 mg 氯吡格雷（波立維）、20 mg 阿托伐他汀鈣片，并在PCI 過程中靜脈注射50～100 IU/kg 肝素。

1.3.3 RNA 提取和qRT-PCR：采用miRNA 提取試劑盒提取總RNA，然后利用Nanodrop 評估RNA的質量。取5 ng 總RNA，采用TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用miRNA-specific TaqMan MiRNA 檢測試劑盒用于測定miRNAs 的含量，以U6 作為內參。反應條件：預變性95℃，3 min；變性 95℃，30 s，退火58℃，20 s, 延伸72℃，20s，30 個循環。每個樣本設置三個復孔。每組實驗獨立重復三次。miR-186-5p，miR-23b，miR-652 相對表達水平用2-△Ct法表示，其中△Ct=（Ct目的miRNA-Ct內參U6）。miR-186-5p 引物：CAAAGAATTCTCCTTT；miR-23b 引物：ATCACATTGCCAG；miR-652 引物：ATCACATTCAACCCTAGGAGAGGG。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0進行統計學分析。數據以M (P25, P75)表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，三組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用Spearman 分析miRNA 水平與cTnI 之間的相關性。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic, ROC) 評估診斷價值。曲線下面積（area under cure，AUC）比較采用Z 檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652水平比較 見表1。AMI 患者血清中miR-186-5p，miR-23b 水平均顯著高于對照組（Z=6.451，5.087, 均P=0.000）；UAP患者血清中miR-23b 水平顯著高于對照組（Z=4.995，P=0.000）。AMI 患者血清中miR-652 水平顯著高于對照組（Z=5.436, P=0.000）；UAP 患者血清中miR-652水平顯著高于對照組（Z=3.312，P=0.001），差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 血清miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平比較[M(P25,P75)]

2.2 不同病變支數患者血清中miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平比較 見表2。不同病變支數的ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平比較不全相同，差異有統計學意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較，三支、雙支病變數的ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b ，miR-652 水平均高于單支，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 不同病變支數患者血清中miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平比較[M(P25,P75)]

2.3 PCI 術前及術后miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平比較 見表3。與術前比較，術后ACS 患者血清中miR-186-5p， miR-23b，miR-652 水平均顯著下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表3 PCI 術前及術后 miR-186-5p, miR-23b, miR-652 水平比較[M(P25,P75)]

2.4 miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平與cTnI的相關性 見表4。進一步通過Spearman 分析ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652水平分別與cTnI 水平的相關性，結果顯示miR-186-5p，miR-23b，miR-652 與cTnI 呈顯著正相關（r=0.689，0.779，0.746，均P=0.000）。

表 4 miR-186-5p，miR-23b，miR-652 與cTnI 相關性

2.5 miR-186-5p，miR-23b，miR-652 對ACS患者的診斷價值 見表5。繪制ROC 受試者工作曲線，并計算AUC。通過計算最大Youden 指數確定最佳診斷臨界值。miR-186-5p 臨界值為0.110 時，AUC 為0.775，靈敏度為61.8%，特異度為91.2%；miR-23b 臨界值為0.133，AUC 為0.799，靈敏度為69.1%，特異度為88.2%；miR-652 臨界值為0.164，AUC·為0.789，靈敏度為67.6%，特異度為91.2%。三者聯用AUC 為0.941，靈敏度為91.2%，特異度為83.8%。cTnI 的AUC為0.857，靈敏度為76.5%，特異度為79.4%。miRNAs 聯 合AUC顯著高于cTnI（Z=2.243,P＜0.05）。見圖1。

表5 各項指標單獨及聯合使用對ACS 患者的診斷價值

3 討論

ACS 是一種由動脈阻塞引起的心血管疾病，死亡率高、預后差[9]。目前ACS 的診斷主要取決于臨床表現和cTnI 的變化，但cTnI 在ACS 早期敏感度低且特異度差[10-12]，因此尋找更高靈敏度和特異度的標記物對ACS 診斷具有重要意義。

ACS 發生過程中會出現多種生理和病理變化，包括內皮功能障礙、斑塊破裂、血小板聚集、冠狀動脈血栓形成、心肌缺血、再灌注損傷等[13]。miRNAs 因其獨特的表達模式、較高的穩定性，正被開發用于心血管疾病的診斷或預后[14]。miR-186-5p 作為其中之一，已被證實在ACS 患者中呈高表達，其高表達后能促進動脈粥樣硬化脂質的積累，增加巨噬細胞中促炎細胞因子分泌，從而加速動脈粥樣硬化病變，最終導致ACS 的發生[15-16]。另一項研究發現miR-23b 在心力衰竭細胞中呈過表達，通過抑制缺氧下細胞的生長速度來促進心肌細胞凋亡[17]。當發生急性心肌組織損傷時，miR-652 在巨噬細胞中呈現高表達，會誘導產生大量炎癥因子，而炎癥因子會進一步促進巨噬細胞的增殖、分化，從而加速斑塊損傷，導致ACS 發生[18-19]。基于此，本文檢測了非ACS 患者和ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平，發現ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平顯著升高，這與之前的研究結果一致[6-8]。進一步發現三支、雙支病變數患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平均高于單支。表明miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平與ACS 患者病情嚴重程度密切相關。分析對比PCI 術前、術后ACS 患者血清中miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平變化，結果顯示術后miRNAs 水平顯著降低。因此，miRNAs 水平變化可以用于觀察ACS 患者再灌注治療后的病情進展情況。

早期研究發現miR-186-5p 聯合脂質參數與炎癥指數在ACS診斷中具有優良的性能（AUC為0.94）[6]。miR-23b（AUC 為0.809）在AMI 的診斷上能力優于傳統CK-MB（AUC為0.753）和cTnI (AUC為0.783)[7]。miR-652 水平在ACS 急性期顯著升高，與ACS 的預后相關[8]。本文分析發現，miR-186-5p，miR-23b，miR-652 水平與cTnI 呈顯著正相關，推測miR-186-5p，miR-23b，miR-652 可能與cTnI 具有相似的ACS診斷能力。進一步繪制ROC 曲線，結果表明miR-186-5p，miR-23b 聯合miR-652 (AUC 為0.941)診斷能力優于cTnI (AUC 為0.857)，且靈敏度（91.2% vs 83.8%）和特異度（76.5% vs 79.4%）高于cTnI。

總之，本文證實了miR-186-5p，miR-23b，miR-652 聯合使用診斷ACS 優于cTnI，為ACS 的診斷提供臨床參考價值。