兒童哮喘患者外周血ILC2細胞和Th2型細胞相關因子水平變化及與臨床相關性研究

李曉剛，鄧巧妮，王軍煥，葛君俐，康 茹

（1.寶雞高新人民醫院a.兒科；b.檢驗科，陜西寶雞 721000；2.西北婦女兒童醫院檢驗科，西安 710061）

支氣管哮喘是由多種炎性細胞及細胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應性、黏液分泌增多及可逆性氣流受限，晚期還可能出現氣道重塑[1]。目前，哮喘發病機制尚未完全明確，但既往眾多研究表明哮喘的發生發展與免疫炎癥反應形成相關[2]。經典的免疫學說認為，哮喘是以Th2 型免疫反應為主的氣道炎癥疾病，Th1/Th2 免疫失衡是哮喘發病的重要免疫學機制，正常機體內Th0 按一定比例向Th1 和Th2 分化，兩者維持相對平衡[3]。哮喘發生時，多因素作用使Th0 趨向于Th2 分化，并分泌大量2 型細胞炎性因子（如IL-4，IL-5，IL-13），啟動一系列炎性反應過程，誘發哮喘的發生[4]。近年研究發現[5]，固有免疫細胞（innate lymphoid cells，ILCs）在機體炎癥應答、抗感染免疫及組織重塑和修復中發揮重要作用，其不同分類中ILC2細胞能夠分泌Th2 型細胞因子，與嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及自然殺傷細胞等共同參與哮喘的發生。并發現過敏性哮喘小鼠模型中，ILC2與嗜酸性粒細胞介導的炎癥反應相關[6]。過敏性哮喘患者外周血、痰及肺泡灌洗液中ILC2 數量有所升高[7]。ILC2 細胞具有獨立分泌Th2 型細胞因子的能力，提示ILC2 細胞可能通過產生Th2 型細胞因子進而參與了哮喘的發生發展[8]。為揭示ILC2與哮喘病情的關系，為臨床診療提供理論參考，本研究對我院67 例急性發作期支氣管哮喘患兒外周血中ILC2 細胞及Th2 型細胞因子水平進行檢測分析，探究了其與哮喘患兒病情的相關性，現總結如下：

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月～2020年5月在寶雞高新人民醫院確診的67 例急性發作期支氣管哮喘患兒作為研究對象，根據發病嚴重程度分為重度-危重組23 例和輕-中度組44 例；另選取同期健康體檢的45 例兒童作為對照組。哮喘組兒童年齡6～12 歲，平均年齡7.3±4.3 歲，男性38 例，女性29例；對照組兒童年齡6～14歲，平均年齡8.6±3.7歲，男性25 例，女性20 例；兩組年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05）。

納入標準：支氣管哮喘的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中診斷標準[9]；年齡6～14 歲；無呼吸道感染病史；無全身免疫缺陷性疾病及先天性嚴重疾??；對照組為我院接受體檢的健康兒童；本研究經我院醫學倫理委員會批準，家屬均知情同意。

排除標準：存在嚴重肝腎功能障礙；并發血液系統疾病及惡性腫瘤；支氣管發育畸形或支氣管異物；肺部感染者；入組前近期內應用激素等藥物史、既往有哮喘家族病史、肺功能異常等。

1.2 儀器及試劑 流式抗體：Lineage，Anti-human CD45 APC，Anti-human CD127 PE-Cyanine7，Anti-Human CRTH2 PE 購自美國Thermo Fisher Scientific公司；ELISA 試劑盒購自江蘇科特生物科技有限公司；DG5033A 酶標儀購自北京普朗醫用設備有限公司；Master Screen 肺功能儀購自德國JAEGER 公司。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本采集：于入院后次日清晨采集兩組兒童空腹外周靜脈血5 ml，其中3 ml 置入EDTA抗凝管，采用Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單核細胞PBMC，轉移至EP 管，-20 ℃低溫保存；另外2 ml 靜脈血2 000 r/min 離心10 min，留取血清，-20 ℃保存待檢。

1.3.2 外周血 ILC2 細胞檢測：分離的外周血PBMC 細胞，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入PBS 調整細胞濃度至1×103個/ml，加入FCR 阻斷劑孵育20 min，加入流式抗體，4 ℃孵育30 min，PBS 洗滌，離心棄上清，PBS 重懸細胞沉淀，采用流式細胞術檢測ILC2，以外周血標本中出現Lin-CD45+CD127+CRTH2+淋巴細胞群定義為ILC2 細胞。

1.3.3 外周血Th2 型細胞因子水平檢測：取靜脈血離心后上層血清，采用ELISA 法按檢測試劑盒說明書行血清Th2 型相關細胞因子IL-4，IL-5，IL-10，IL-13 水平檢測，使用DG5033A 酶標儀于波長450 nm 處檢測A 值，取其平均值作為相對含量。

1.3.4 肺功能指標檢測：采用Master Screen 肺功能儀檢測入組支氣管哮喘患兒及正常兒童第一秒用力呼氣量（forced expiratory volume in 1s，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）及最大呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF），評估其肺功能。

1.4 統計學分析 采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析，計數資料采用n（%）表示，組間采用χ2檢驗。計量資料符合正態分布的采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗；不服從正態分布以中位數和四分位數表示，采用Mann-Whitney U 檢驗。相關性分析采用Pearson 線性相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血ILC2 細胞比例及Th2 型細胞因子水平比較 見表1。 與對照組相比，支氣管哮喘組患兒外周血ILC2 細胞比例及IL-4，IL-5，IL-13 水平明顯升高，IL-10 水平明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；重度-危重組支氣管哮喘患兒以上指標變化較輕-中度組更為顯著，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 外周血ILC2 細胞比例及Th2 型細胞因子水平比較（±s）

表1 外周血ILC2 細胞比例及Th2 型細胞因子水平比較（±s）

指標 支氣管哮喘組（n=67） 對照組(n=45) F P重度-危重組(n=23) 輕-中度組(n=44) t P ILC2（%） 0.08±0.06 0.04±0.03 3.650 0.000 0.02±0.01 24.419 ＜0.001 IL-4（ng/L） 54.7±4.3 49.2±5.1 4.413 0.000 25.7±8.4 209.627 ＜0.001 IL-5（ng/L） 76.6±9.4 68.3±8.5 3.659 0.000 42.8±11.6 112.640 ＜0.001 IL-10（ng/L） 9.7±3.9 11.8±4.2 1.990 0.025 22.3±5.7 80.826 ＜0.001 IL-13（ng/L） 42.4±5.8 38.6±4.5 3.076 0.002 24.6±5.4 122.855 ＜0.001

2.2 兩組肺功能指標比較 見表2。與對照組相比，支氣管哮喘組患兒肺功能指標FVC，FEV1，PEF明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。重度-危重組支氣管哮喘患兒肺功能指標降低較輕-中度組更顯著，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 肺功能指標比較（±s）

表2 肺功能指標比較（±s）

指標 支氣管哮喘組（n=67） 對照組(n=45) F P重度-危重組(n=23) 輕-中度組(n=44) t P FVC（%） 65.4±8.3 73.2±7.4 3.929 0.000 92.4±6.7 128.697 ＜0.001 FEV1（%） 59.2±4.9 69.5±5.2 7.848 0.000 90.4±5.9 298.942 ＜0.001 PEF（%） 66.1±6.7 74.5±7.9 4.343 0.000 99.7±10.8 119.982 ＜0.001

2.3 支氣管哮喘組患兒外周血ILC2 及Th2 型細胞因子水平與肺功能指標的相關性 見表3。 支氣管哮喘患兒外周血ILC2 細胞比例及IL-4，IL-5，IL-13 水平與FVC，FEV1，PEF 呈顯著負相關關系，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；IL-10 水平與FVC，FEV1，PEF 呈顯著正相關關系，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 相關性分析結果

3 討論

支氣管哮喘主要由T 淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及上皮細胞等氣道炎性細胞及結構細胞和細胞組分參與形成[1-2]。Th2 型免疫學說認為，免疫功能紊亂和抗原特異性Th2 細胞過度分化介導的適應性免疫應答是哮喘發病的主要因素[3,10]。抗原進入機體被抗原提呈細胞識別并激活T 細胞（Th2 細胞），使之活化分泌IL-4，IL-5，IL-13 等細胞因子，促使B 細胞產生特異性IgE 抗體；IgE 與肥大細胞、嗜酸性粒細胞表面受體結合將其激活，促進組胺等多種活性炎性介質[11]；Th2 細胞分泌的細胞炎性因子選擇性作用于肥大細胞、嗜酸性粒細胞/嗜堿性粒細胞，引起哮喘相應病理改變，共同參與了哮喘的氣道炎癥反應及發病。近年發現[3,5]，ILC2 細胞與哮喘慢性炎癥密切相關，其不僅在固有免疫應答中發揮重要作用，且可在IL-33，胸腺基質淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP）、脂質遞質半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes, CYSLT）等因子的刺激下分泌Th2 細胞因子，參與Th2 型免疫炎癥反應，為哮喘發病機制的研究提供了新的思路。

ILCs 是新發現的一類具有淋巴細胞特征，但缺乏特異性抗原識別受體的非T、非B 細胞，主要存在于黏膜組織，其通過釋放相關細胞因子或介質進而調節免疫反應，在多種過敏性與非過敏性炎癥疾病中發揮重要作用[12]。ILCs 根據其產生的效應細胞因子不同分為ILC1，ILC2，ILC3 三類[3]。研究表明，上皮細胞源性細胞因子IL-25 和IL-33 可激活ILC2 使其快速分泌IL-5，IL-9，IL-13 等Th2 型細胞因子，參與過敏性炎癥、抗蠕蟲感染及組織修復[13]。ILC2 與Th2 細胞在表型及功能上相似，被認為是Th2 型細胞的主要來源[6]。研究表明[14]，不同致敏原刺激下，ILC2 可產生大量Th2 型細胞因子，引起嗜酸性粒細胞聚集、浸潤及氣道高反應性和氣道炎癥。過敏源刺激下氣道壁細胞分泌IL-33引起ILC2 激活分泌IL-5，IL-13，參與哮喘免疫應答過程[15]。哮喘患者外周血中ILC2 比例及數量與嗜酸性粒細胞計數及IgE 呈正相關；過敏性哮喘患者外周血中ILC2 比例及數量高于非過敏性哮喘患者[16]。且發現給予IL-33 刺激時人外周血中ILC2可生成IL-13，同時在成人肺組織中也發現ILC2，證實IL-33 可激活ILC2 引起肺組織Th2 型免疫應答[17]。大量研究已證實，ILC2 在以嗜酸性粒細胞浸潤為特征的過敏性哮喘發病中具有重要作用。

本研究檢測顯示，支氣管哮喘患兒外周血中ILC2 細胞比例及Th2 型細胞因子水平較正常兒童表達異常，與哮喘嚴重程度密切相關（P＜0.05）。這是由于損傷的氣道上皮細胞分泌的IL-33 等內源性炎性介質，誘導ILC2 細胞大量增殖，引起IL-4，IL-5，IL-13 等大量分泌。此外，嗜酸性粒細胞在氣道壁聚集分泌大量炎性因子是支氣管哮喘的重要標準，其介導的Th2 細胞活化及炎癥浸潤是支氣管哮喘氣道高反應性及氣道炎癥的病理基礎[18]。IL-4 與其受體表達可促進抗原激發造成嗜酸性粒細胞聚集，形成氣道高反應性，引起氣道黏液過度分泌；IL-5 通過調節嗜酸性粒細胞的生長、分化及活性，趨化其向氣道轉移，參與哮喘氣道炎癥反應；IL-13 則通過誘導多種細胞因子表達促進肺部大量嗜酸性粒細胞浸潤，且能與炎性因子協同作用，引起哮喘氣道炎癥的發生及肺氣腫和肺上皮細胞的黏液化生，加重支氣管哮喘病理過程[19-20]。同時IL-10 作為多功能抑制性細胞因子，其表達下降，導致T 淋巴細胞應答水平顯著上升，促使呼吸道高氣道反應性發生改變[21]。經對比兩組肺功能發現，支氣管哮喘患兒肺功能指標較正常兒童顯著降低，重度-危重組患兒肺功能指標降低更顯著（P＜0.05） 。相關分析顯示，支氣管哮喘患兒外周血ILC2 細胞比例及Th2 型細胞因子水平與其肺功能指標具有顯著相關性（P＜0.01），進一步提示ILC2 細胞及Th2 型細胞因子表達與哮喘患兒病情嚴重程度及肺功能顯著相關，可能由于ILC2 細胞分泌的Th2 型細胞因子的異常改變影響了炎癥反應、呼吸道重塑及平滑肌的增殖，進而影響肺功能發生變化，提示外周血ILC2 細胞及Th2 型細胞因子參與哮喘發病過程且扮演重要角色。目前針對ILC2 的研究提示其參與哮喘氣道炎癥調控，有望成為哮喘治療的新靶點，而靶向ILC2 活化前后進行的一系列新的治療方法的嘗試為哮喘治療提供了新的希望[22]。然而ILC2 調控哮喘的具體作用機制尚未完全明了，其在不同表型哮喘中的作用差異也尚不明確，還需更深入的研究以完善其在哮喘中的作用機制。此外，國內外開展的有關ILCs 的一系列相關研究使人們更好更全面地認識了免疫反應在哮喘發病中的重要作用，為研究哮喘發病機制及臨床治療提供了新的方向及路徑[23]。但目前基于ILCs 在哮喘發病中的機制研究有限，其各種亞型在哮喘發病中是否存在相互抑制或協同活化作用，其在機體內具體發揮怎樣的作用還有待進一步探索。因此，深入探究ILC2 在哮喘中的作用機制，進一步探究其與適應性免疫細胞間的相互關系，明確ILCs 的作用，開發更多ILCs 通路相關分子抑制藥物或拮抗劑，阻斷ILCs 的活化作用，可為哮喘臨床治療提供新的策略。

綜上所述，急性發作期支氣管哮喘患兒外周血清中ILC2 細胞比例及其相關的Th2 型細胞因子水平明顯增高或降低，且與哮喘患兒肺功能具有顯著線性相關性，對其進行檢測有助于評估支氣管哮喘患兒病情程度，可為臨床治療提供理論參考。