陜西省延安地區(qū)漢族與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)育齡婦女MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型和等位基因分布研究

師文濤，白 蓉，黃劍林，雷杰喻

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安 716000）

葉酸是一種水溶性維生素，其分子小，又稱(chēng)為維生素B9，其主要以離子形式參與人體的細(xì)胞增殖、基因活性調(diào)節(jié)、紅細(xì)胞和白細(xì)胞的產(chǎn)生、皮膚和腸系膜代謝，是調(diào)節(jié)大腦功能化學(xué)物質(zhì)的合成等多種重要生化過(guò)程的必須化合物；葉酸既可以化學(xué)合成也可以天然獲得[1]；育齡婦女適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充葉酸可有效預(yù)防出生缺陷的發(fā)生[2]。

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydr ofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶。MTHFR C677T 是目前發(fā)現(xiàn)MTHFR 最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，存在CC，CT 和TT 三種基因型，基因位點(diǎn)多態(tài)性影響著其編碼的酶活性、血清和紅細(xì)胞葉酸濃度以及血漿Hcy 濃度的變化[3-4]。2017年《圍受孕期增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷指南》中提出，育齡婦女每日服用葉酸降低新生兒出生缺陷率，并建議MTHFR C677T 位點(diǎn)TT 基因型患者應(yīng)當(dāng)酌情增加葉酸補(bǔ)充劑量或延長(zhǎng)孕前補(bǔ)充時(shí)間[5]。相關(guān)研究表明，MTHFR 基因突變導(dǎo)致新生兒發(fā)生出生缺陷概率為13.4%，并有逐年上升的趨勢(shì)[6]。MTHFR C677T 基因在不同國(guó)家、地區(qū)、民族的分布具有明顯差異，亞洲居中且占2.5%～36%。目前國(guó)內(nèi)其他地區(qū)關(guān)于育齡婦女MTHFR C677T 基因多態(tài)性的地域分布報(bào)道很多，但延安地區(qū)還未見(jiàn)有大數(shù)據(jù)的相關(guān)研究。本研究以陜西省延安地區(qū)漢族女性為研究對(duì)象，通過(guò)探討12 557 例延安地區(qū)育齡婦女MTHFR C677T 基因分布特征，旨在為本地區(qū)育齡婦女預(yù)防MTHFR C677T 基因突變引起的新生兒出生缺陷及其相關(guān)疾病提供參考依據(jù)，指導(dǎo)育齡婦女科學(xué)補(bǔ)服葉酸。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取對(duì)象為2015年1月～2020年6月期間，到延安大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行孕檢的12 557 例漢族女性，全部來(lái)自于陜西省延安市，年齡15～49 歲，平均年齡29.02±5.21 歲。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者具有知情權(quán)并簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑 核酸提取及純化試劑、免疫顯色試劑、MTHFRC677T 基因檢測(cè)試劑盒均由上海百傲科技股份有限公司提供，嚴(yán)格按照檢驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 方法 采集研究對(duì)象乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血，提取DNA，完全按照MTHFR 基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。采用DNA 微陣列芯片法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系22μl，反應(yīng)條件：50℃5min；94℃5min；94℃25s，56℃25s，72℃25s，35 個(gè)循環(huán)；72℃5min。反應(yīng)完成后，利用PCR-芯片雜交法檢測(cè)，并應(yīng)用分析軟件識(shí)讀芯片的基因分型，確定其結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2019，SPSS18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，卡方檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 延安地區(qū)育齡婦女MTHFR C677T 基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡分析 見(jiàn)表1。MTHFR C677T 有CC，CT，TT 三種基因型。研究群體MTHFR C677T 基因多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，說(shuō)明數(shù)據(jù)來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w。

2.2 延安地區(qū)與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)育齡婦女MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型和等位基因分布 見(jiàn)表2。延安地區(qū)女性MTHFR C677T 各基因型分布和基因頻率分布情況與尚志、長(zhǎng)春、遼源、延邊、張家口、懷來(lái)、北京、廊坊、淶水、煙臺(tái)、淄博、濰坊、新鄉(xiāng)、濟(jì)源、鄭州、鎮(zhèn)江、麻城、德陽(yáng)、郫縣、南充、武漢、遂寧、英山、荊州、松滋、眉山、紹興、九江、長(zhǎng)沙、湘潭、昆明、河源、廣州、惠州、南寧、珠海、瓊海[7-8,10-43]的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），與烏魯木齊[9]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。從各地區(qū)MTHFR C677T 基因型分布整體來(lái)看，純合突變型TT 呈現(xiàn)北高南低的趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）；并且各個(gè)地區(qū)T 等位基因頻率呈現(xiàn)隨著緯度下降而下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖2）。

表1 研究群體MTHFR C677T 位點(diǎn)遺傳平衡分析

3 討論

出生缺陷在我國(guó)較為常見(jiàn)，每年新增出生缺陷人數(shù)約90 萬(wàn)。我國(guó)常見(jiàn)的出生缺陷包括神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、先天性心臟病、唐氏綜合征等。導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的因素非常復(fù)雜，一般認(rèn)為出生缺陷的發(fā)生受環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)攝入情況、遺傳等因素共同影響[45-46]。近年來(lái)，遺傳因素影響越來(lái)越受人們重視。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)出生缺陷的病因?qū)W從分子層面進(jìn)行的研究逐漸深入，補(bǔ)充葉酸預(yù)防出生缺陷已達(dá)成共識(shí)。如能孕前補(bǔ)充適宜劑量葉酸可降低出生缺陷的發(fā)生，減輕因患兒出生缺陷所致家庭、社會(huì)負(fù)擔(dān)及降低大量醫(yī)療費(fèi)用支出[5]。

本研究通過(guò)開(kāi)展MTHFR C677T 基因多態(tài)性的地區(qū)特征研究，發(fā)現(xiàn)延安地區(qū)MTHFR C667T 基因型CC，CT，TT 的頻率分別為25.5%，50.4%和24.0%。葉酸代謝關(guān)鍵酶MHTFR C677T 基因多態(tài)性會(huì)影響酶的活性，可介導(dǎo)同型半胱氨酸在人體內(nèi)清除，促進(jìn)DNA 甲基化反應(yīng)。有臨床研究表明，MTHFR C677T TT 型較CC 型酶活性降低60%～70%；在攝入等劑量葉酸情況下，TT 型相比CT，CC 型個(gè)體血清葉酸水平降低20%左右[47]；在血清葉酸濃度低時(shí)，TT 型相比CT，CC 型個(gè)體同型半胱氨酸高30%左右[48]。MTHFR C677T 等位基因的突變與其他各地區(qū)存在差異，具有地域特異性。根據(jù)數(shù)據(jù)分析得出，北方城市T 等位基因頻率高于南方城市，該研究結(jié)果與向長(zhǎng)港等[33]人研究結(jié)果一致。MTHFR C677T 基因多態(tài)性可能受地形地貌、氣候、生活習(xí)慣、飲食等因素影響，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的基因突變形成的結(jié)果。然而，基因多態(tài)性的發(fā)生是由于哪些主要因素決定，需要今后更精細(xì) 的調(diào)查研究。

表2 不同地區(qū)MTHFR 等位基因型頻數(shù)和基因頻率分布特征[n(%)]

圖1 各地區(qū)人群中MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)多態(tài)性分布

圖2 各個(gè)地區(qū)MTHFR C677T 位點(diǎn)等位基因（C,T）隨緯度變化趨勢(shì)

葉酸主要存在于植物的葉綠體中，高溫會(huì)導(dǎo)致大量失活，我國(guó)飲食主要以烹飪?yōu)橹鳎詫?shí)際能被人體吸收、利用的葉酸有限。孕期婦女對(duì)葉酸需求量大，甚至需要翻倍補(bǔ)充，一部分人由于MTHFR C677T 基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致葉酸利用轉(zhuǎn)化能力下降，這樣極易出現(xiàn)葉酸缺乏。

國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，將葉酸加入面粉中，提高公眾葉酸的攝入量，可以有效預(yù)防新生兒出生缺陷的發(fā)生[49]。速存梅等[50]人證實(shí)農(nóng)村婦女血清葉酸及紅細(xì)胞葉酸水平明顯低于城市育齡婦女，神經(jīng)管畸形患兒出生率農(nóng)村高于城市；有研究專(zhuān)門(mén)針對(duì)農(nóng)村婦女進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，每次服用0.4mg葉酸，1 次/天，服用至少3 個(gè)月，或者每次服用4mg 葉酸，1 次/天，服用1 個(gè)月以上時(shí)，紅細(xì)胞葉酸濃度才能達(dá)到預(yù)防神經(jīng)管畸形的有效水平[51]。

綜上所述，針對(duì)育齡婦女MTHFR C677T 不同基因型并結(jié)合患者孕產(chǎn)史、家族史等因素綜合評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，并按照個(gè)體化原則參考血液同型半胱氨酸水平和紅細(xì)胞葉酸濃度，酌情增加補(bǔ)充葉酸劑量或延長(zhǎng)孕前增補(bǔ)時(shí)間。同時(shí)，建議育齡婦女多食用含葉酸的食物，養(yǎng)成健康規(guī)律的生活方式。因此，基于該地區(qū)研究結(jié)果，了解 MTHFR C677T 與葉酸利用代謝的關(guān)系，為臨床醫(yī)生指導(dǎo)地區(qū)人群補(bǔ)充葉酸提供基礎(chǔ)理論依據(jù)；也為降低本地區(qū)出生缺陷及制定公共衛(wèi)生政策提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。