布魯氏菌血清IgM,IgG抗體膠體金免疫層析檢測方法的建立及初步臨床應用

劉涵軒，伍 波，趙正春，陳 超，韓 露，梁 辰，薛 輝，馮 杰，顏光濤

(1.北京中檢安泰診斷科技有限公司，北京 102600；2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心醫(yī)學檢驗中心，北京 100853)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患的自然疫源性傳染病。該病在160 多個國家和地區(qū)有存在和流行[1]。在我國，2005～2016年布魯氏菌病疫情總體呈上升趨勢，2014年全國疫情達到歷史記載的最高水平[2]。布魯氏菌病的明確診斷依賴于可疑患者體液中致病細菌的證明，通常通過培養(yǎng)鑒定[3]。快速準確的診斷是控制該疾病的關鍵步驟。目前常用的實驗室方法不能同時具備檢測過程快速靈敏、使用環(huán)境多樣、操作要求簡單以及高性價比等特點[4]。膠體金免疫層析法具有樣本用量少、易于操作、檢測速度快、準確度較高等優(yōu)點，可在實驗室和應用現(xiàn)場進行疾病的快速診斷和篩查[5]。

研究表明，IgM 抗體檢測對布魯氏菌病急性期診斷有意義，而IgG 抗體檢測對慢性布魯氏菌病診斷有較高的參考價值[6]。本文建立了一種可同時測定布魯氏菌病IgM 抗體和IgG 抗體膠體金免疫層析分析方法，為布魯氏菌病的早期診斷提供了新的技術工具，有一定的臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 研究對象 400 份被檢血清來自內(nèi)蒙古地區(qū)醫(yī)院，200 份陰性血清來自非布魯氏菌病流行區(qū)醫(yī)院體檢健康人群。高總膽紅素、高血脂和溶血陽性血清均來自北京中檢安泰診斷科技有限公司保存質(zhì)控品。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器設備：XYZ3060 三維噴點平臺、CM4000 切條機購自Biodot 公司；MK3 酶標儀購自美國熱電公司。

1.2.2 主要試劑：重組布魯氏菌抗原、鼠抗人IgG單克隆抗體、鼠抗人IgM 單克隆抗體、兔抗布魯氏菌多克隆抗體、硝酸纖維素膜CNC、金標墊購自某生物原料公司；布魯氏菌試管凝集試驗抗原購自青島中創(chuàng)生物科技有限公司；布魯氏桿菌IgG 和IgM抗體檢測試劑盒（ELISA 法）購自美國DRG 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑盒檢測方法的建立

1.3.1.1 膠體金顆粒的選擇目標:選擇制備粒徑大小為30 nm 的膠體金，在100ml 純化水中加入4ml 1g/dl 氯金酸煮沸、在攪拌條件下加入1.6ml 的4g/dl 枸椽酸三鈉溶液，煮沸5 min。放置于室溫環(huán)境自然冷卻，應用0.22 μm 濾膜過濾后定容到原體積，室溫避光保存?zhèn)溆谩Ｓ^察膠體金溶液的物理性狀，取10ml 溶液在波長400nm～700nm 范圍內(nèi)進行掃描，測定其最大吸收峰。

1.3.1.2 膠體金標記最適pH 值的選擇:取若干個1.5ml 試管，分別加入1ml 膠體金；用0.1mol/L K2CO3或5 mol/L 鹽酸將pH 分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10。分別取不同pH 值的膠體金溶液100μl 加到酶標孔內(nèi)，3μl 濃度為1mg/ml 的重組布魯氏菌抗原，混勻，室溫放置15min；每孔分別加入20μl 10g/dl NaCl 溶液，混勻，室溫放置2 h，在酶標儀上讀取522nm 波長下吸光度值；記錄吸光度值變化最小的pH 值（X）。再將pH 值按梯度調(diào)為X-1.0，X-0.5，X，X+0.5，X+1，重復上述步驟，保持吸光度值變化最小的pH 值為最佳pH 值[7]。

1.3.1.3 膠體金標記重組:布魯氏菌抗原標記量的確定首先采用鹽沉淀法選擇重組布魯氏菌抗原的最低標記量，然后用交叉配比法選出重組布魯氏菌抗原的最佳標記量。取8 支試管，分別加入的膠體金溶液1ml；各試管依次加入不同質(zhì)量濃度的重組抗原（0，5，10，15，20，25，30 和35μg/ml），混勻，室溫放置40min；加入20μl 10g/dl NaCl，室溫下放置2h；顏色仍保持紅色的為標記的最低重組抗原用量。通常在此基礎上增加20%的重組抗原量即為標記時所需重組抗原的最佳量。

1.3.1.4 免疫層析NC 膜的制備:根據(jù)本試驗前期研究，確定檢測線包被濃度為鼠抗人IgG 1.0mg/ml，鼠抗人IgM 1.0mg/ml；質(zhì)控線包被濃度為兔抗布魯氏菌抗體2.0mg/ml。用三維噴點平臺分別在NC膜上進行劃線，噴點量為0.1μl/mm，相隔0.5cm，37℃干燥3h 備用。

1.3.1.5 膠體金免疫層析試劑條的組裝:將樣品墊（濾血膜和玻璃纖維）、膠體金結合墊、制備完成的NC 膜和吸水墊依次貼上PVC 板，切割為每條0.36cm，裝入有干燥劑的鋁箔袋中密封，4℃保存。

1.3.1.6 檢測方法和判定標準:選擇血清/血漿加樣量為10μl，全血加樣量為20μl，加100μl 樣本稀釋液，15 ～20min 為加樣判讀時間。若質(zhì)控線和IgG 檢測線處均出現(xiàn)紅色條帶，表明樣品IgG 為陽性；若質(zhì)控線和IgM 檢測線處均出現(xiàn)紅色條帶，表明樣品IgM 為陽性；若質(zhì)控線、IgG 檢測線和IgM檢測線處出現(xiàn)3 條紅色條帶，表明樣品IgM 和IgG均為陽性；若只有質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶，表明樣品為陰性；若質(zhì)控線處不出現(xiàn)紅色條帶則說明該試紙條失效。

1.3.2 性能評估

1.3.2.1 分析靈敏度:取一個布魯氏菌IgG 最低檢出限企業(yè)參考品原始血清（ELISA 檢測結果S/C 值為3.85，復檢誤差小于5%）和一個布魯氏菌IgM最低檢出限企業(yè)參考品原始血清（ELISA 檢測結果S/C 值為3.33，復檢誤差小于5%）。將兩個血清分別用生理鹽水梯度調(diào)整為：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16和1∶32；以健康人的陰性血清作為對照,每個濃度樣本用膠體金試劑盒檢測三次。結果出現(xiàn)陽性信號的血清最高稀釋度作為最低檢出限。最低檢出限可反映試劑盒的靈敏度。

1.3.2.2 特異度:收集200 份健康人血清標本，經(jīng)試管凝集試驗檢測布魯氏菌抗體為陰性，用膠體金試劑盒進行復檢。

1.3.2.3 干擾試驗:通過干擾實驗驗證高膽紅素、溶血、高血脂對檢測試劑盒的影響。準備3 個濃度(S/C 值分別為2.23，3.25，5.56；編號P1，P2，P3)的布魯氏菌IgG 陽性標本一組，3 個濃度(S/C值分別為2.44，3.33，5.44；編號N1，N2，N3)的布魯氏菌IgM 陽性標本一組，每組設實驗管和對照管各一個。①高膽紅素干擾實驗:將各組血清分別用正常人血清、80μmol/L 和160μmol/L 高總膽紅素血清2 倍稀釋各組血清，充分混勻后檢測。②溶血干擾實驗：用正常人血清、10g/L 血紅蛋白血清和20g/L 血紅蛋白血清2 倍稀釋各組血清，充分混勻后檢測。③高血脂干擾實驗:用正常人血清、12mmol/L 高血脂血清和18mmol/L 高血脂血清2 倍稀釋各組血清，充分混勻后檢測。

1.3.3 初步臨床應用: 用所制備的布魯氏菌膠體金試紙條對采集自內(nèi)蒙古牧區(qū)某醫(yī)院的200 份血清進行檢測，同時用試管凝集法做平行試驗，比較兩者的符合率情況，評價該方法的臨床應用價值。

1.4 統(tǒng)計學分析 檢測結果采用 SPSS Statistics 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 檢測方法的評價

2.1.1 膠體金溶液的鑒定：肉眼觀察膠體金溶液顏色鮮紅、清亮，無混濁及漂浮物，由圖譜可見其最大波峰出現(xiàn)在522nm 處，峰形狹窄（見圖1）。說明制備的膠體金溶液顆粒大小分布均勻，透光性和穩(wěn)定性良好。

圖1 膠體金溶液紫外-可見光譜圖

2.1.2 最佳標記pH 值的確定：見圖2。當pH 值為7.5～9.0 范圍時其吸光度只有微小變化，溶液保持紅色，無明顯區(qū)別，所以本試驗最終確定膠體金標記抗體的最佳pH 值為7.5。

圖2 標記重組抗原溶液的pH 值測定曲線

2.1.3 重組布魯氏菌抗原最佳標記量的確定：見表1。從6 號管后顏色基本趨于穩(wěn)定，溶液顏色沒有明顯變化。6 號管所加標記用重組布魯氏菌抗原標記量為25μg/ml。在此基礎上增加20%，其抗原最適標記質(zhì)量濃度為30μg/ml。

表1 膠體金最適標記重組抗原量的確定

2.2 膠體金試紙條的性能評價結果

2.2.1 靈敏度結果：本檢測試劑檢測不同稀釋度的布魯氏菌陽性血清最低檢出限參考品血清，當稀釋度為1 ∶8 時檢測線仍可顯示清晰，表明該檢測試紙條具有良好的靈敏度。

2.2.2 特異度檢測結果：檢測200 份健康人血清標本，其中195 份樣本結果為陰性，本檢測試劑特異度為97.5%。其中，布魯氏菌IgG 抗體檢測陽性例數(shù)為3 份，布魯氏菌IgM 抗體檢測陽性例數(shù)為2 份。

2.2.3 干擾試驗結果：見表2。實驗結果發(fā)現(xiàn)高總膽紅素、高血脂和溶血陽性血清與正常陰性血清差異較小，并不干擾膠體金試劑卡對陰性樣本檢測的結果判定，但干擾膠體金試劑卡對陽性樣本檢測的結果判定。血清總膽紅素、血脂和血紅蛋白濃度的增高均會使試紙條顯色結果減弱。當血清總膽紅素、血脂和血紅蛋白濃度過高時，會使試紙條出現(xiàn)假陰性反應。

2.3 臨床樣品的檢測 對采集自內(nèi)蒙古牧區(qū)某醫(yī)院的400 份血清，采用本方法制備的膠體金試紙條進行檢測。結果檢出IgG 抗體陽性樣本25 份，陽性率6.25%；IgM 抗體陽性樣本10 份，陽性率2.5%，IgG 和IgM 抗體均陽性樣本5 份。綜上，采用本方法制備的膠體金試紙條共檢出陽性樣本30份，陽性率7.5%。試管凝集試驗方法檢出的陽性樣本為32 份，陽性率8.0%，二者的陽性符合率為93.75%。膠體金試紙條檢出的陽性樣本均來自試管凝集試驗方法檢出的陽性樣本。

心理健康通常指個體心理在其自身以及環(huán)境條件允許的范圍內(nèi)所保持的良好功能和狀態(tài)。教師的心理健康體現(xiàn)為教師心理對來自內(nèi)部世界與外部世界沖擊、影響保持良好的平衡與協(xié)調(diào)狀態(tài)，它與教師的身體健康之間會產(chǎn)生極強的互動作用。因此，心理健康是教師優(yōu)質(zhì)完成教育工作的重要前提和保障。教師的心理健康標準除了有與其他行業(yè)的共性之外，還體現(xiàn)著行業(yè)的特殊性，表現(xiàn)為：

3 討論

布魯氏菌病是全球最常見的人畜共患病之一，每年約有500 000 例新病例，對公眾健康構成威脅。建立快速檢測布魯氏菌診斷方法具有非常重要的公共衛(wèi)生學意義[8]。布魯氏菌病的發(fā)病機制復雜，潛伏期最高可有5 個月，其臨床癥狀包括發(fā)燒、頭痛、關節(jié)痛和背痛等，無法和傷寒，瘧疾等疾病區(qū)分[9]。布魯氏菌病診斷基于細菌培養(yǎng)和分子方法（直接測試），以及體外血清學和體內(nèi)過敏性方法（間接測試）。所有標準血清學測試均基于識別布魯氏菌脂多糖（LPS）O 抗原的抗體的檢測[10]。應用膠體金免疫層析法檢測人體內(nèi)抗體，已廣泛用于病毒、細菌及寄生蟲病的免疫診斷[11-12]。

表2 干擾試驗結果

劉亞東等[12-14]研制的膠體金法快速診斷布魯氏菌病診斷試劑，與酶聯(lián)免疫吸附測定檢測和臨床診斷檢測結果的一致性較好。目前現(xiàn)有的膠體金方法檢測布魯氏菌病只能夠檢測IgG 抗體，不能同時檢測IgM 抗體。IgG 抗體是血清中含量最多的免疫球蛋白，IgM 抗體是在感染或免疫后最早產(chǎn)生的免疫球蛋白。有研究報道，對于布魯氏菌感染患者后，首先血清IgM 抗體升高；IgG 抗體隨后呈低水平上升，持續(xù)近一年后下降；治療后IgG 抗體水平降低，當病情再次加重時，IgG 可迅速再次升高[6]。IgM抗體檢測對布魯氏菌病的早期診斷是有益的，IgM和IgG 抗體聯(lián)合測定，可以區(qū)分疾病的急性期和慢性期。

本研究制得的膠體金溶液為澄清透明的紫色液體，狀態(tài)穩(wěn)定良好。根據(jù)文獻和前期研究，我們選擇了最小標記蛋白量的1.2 倍為標記蛋白量，這樣能夠有效避免假陰性和假陽性的現(xiàn)象[15]。

本研究通過優(yōu)化膠體金標記條件、樣品稀釋液、金標墊和樣品墊的制備條件，使產(chǎn)品的靈敏度達到上市產(chǎn)品水平，特異度高，性能良好。

我們用膠體金試劑盒方法和試管凝集試驗這兩種方法同時對臨床樣本進行檢測，結果兩者的陽性符合率為93.75%。本試劑盒方法的檢出率與標準方法之間仍然存在差距，這可能是由于血清樣品中的抗體滴度低所致。但是，以此方法創(chuàng)建的試劑盒沒有假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)。同時，也提示牧區(qū)布魯氏菌感染較多，應及時進行治療和預防。

本試驗方法相較于ELISA 法和試管凝集法相比，不需要添加多種試劑和酶，操作時間和反應時

間均大大減少。同時該方法的特異度和靈敏度也較好。因此，膠體金免疫層析法是布魯氏菌病的理想且快速的檢測方法。參考文獻：

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