喉鱗癌組織中miR-1225-5p和CDC14B蛋白水平表達與臨床病理特征及預后的關系

閆 娟，安 麗，張 杰，拓明祥（延安市人民醫院,陜西延安 716000）

喉癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌最為常見，手術是其主要治療方式，然而晚期患者預后較差，放化療耐藥及術后局部高復發率是晚期患者死亡的主要原因[1]。因此，基于分子水平研究喉癌的發展具有積極意義。miRNA 是由19～24個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，近年研究證實[2-3]，miRNAs 能夠調控人類基因組中約60%的基因，在人類多種惡性腫瘤中表達異常，可通過調節腫瘤細胞生物學行為參與腫瘤的發生發展進程，作為致癌基因或抑癌基因發揮作用。miR-1225-5p 作為腫瘤抑制因子，最先于胃癌研究中被報道表達下調，與胃癌侵襲性表型及不良預后密切相關[4]。膠質母細胞瘤中miR-1225-5p 異常過表達可抑制細胞的增殖、侵襲及遷移，在癌組織中低表達與腫瘤惡性程度顯著相關[5]。細胞分裂周期蛋白14B（cell division cycle 14B，CDC14B）是細胞周期重要調節因子，能夠抑制癌基因的異常表達，防止細胞惡性病變[6]。據研究報道，乳腺癌、肝癌、卵巢癌等[7-8]腫瘤中均見CDC14B低表達，與腫瘤分化程度及病理分期相關。然而目前有關miR-1225-5p 和CDC14B 在喉癌中的表達作用尚不明確。因此，本研究對miR-1225-5p基因和CDC14B 蛋白在喉鱗癌組織中的表達及臨床意義進行探究，現總結如下：

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月～2015年6月在我院行手術切除的67 例喉鱗癌患者癌組織及其配對的癌旁正常組織進行實驗。入組患者均為原發病例，術前未接受任何放化療治療，臨床病理資料完整；排除并發其他部位惡性腫瘤或存在嚴重臟器功能障礙及精神、認知功能障礙等病例。所有組織標本于液氮中低溫保存，制成石蠟標本，用于后續研究。本研究經我院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意。

收集入組67 例喉鱗癌患者病例資料，包括：年齡40～79 歲，平均年齡57.3±7.2 歲，男性56 例，女性11 例；分化程度：高分化41 例，中低分化26例；頸部淋巴結轉移36 例；T 分期：T1～T2 的 40例，T3～T4 的 27 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期38 例，Ⅲ～Ⅳ期29 例；喉癌發生部位：聲門型43 例，聲門上型19 例，聲門下型5 例；既往有吸煙/飲酒史46 例；腫瘤直徑：＜2cm 的35 例，2～4cm 的19 例，＞4cm 的13 例。術后對入組患者進行為期5年隨訪，以死亡或隨訪終止為研究終點，觀察術后總生存情況。

1.2 試劑和儀器 Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR 儀購自瑞士Roche 公司；紫外分光光度計購自上海精科分析儀器廠；逆轉錄試劑盒購自TAKARA 公司；CDC14B 抗體購自美國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 法檢測miR-1225-5p mRNA 相 對表達：取組織樣本研磨勻漿處理，采用Trizol 法提取總RNA，并檢測其濃度及純度，后按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，并以此為模板配置20 μmol/L PCR 反應體系，應用熒光定量PCR儀進行擴增反應，以GAPDH 為內參。引物序列由Invitrogen 設計合成，miR-1225-5p 上游：5’-ACAG TGCGGTCTACGCATGCGTTCGGTAGACAGTCG TAG-3’，下 游：5’-GCGACAGCTGCTTACGTAGG ATGCGCGCATAGCTTGCAG -3’；GAPDH 上 游：5’-GCATGTGATCGATGACAGTTATCAG -3’，下游：5’-GTCCTGATGATGCGTAGCATGATAGC-3’。 反應條件：95 ℃ 10 min 預變性，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，循環40 次，實驗重復3 次取平均值。采用2-△△Ct法分析miR-1225-5p mRNA 相對表達。

1.3.2 SP 免疫組化染色法檢測CDC14B 蛋白表達：取組織樣本切片、脫蠟、水化，PBS 清洗，3g/dl H2O2阻斷內源性過氧化物酶，枸椽酸鹽緩沖液高壓修復抗原；滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，加入一抗，4 ℃過夜；次日，加入生物素化二抗（IgG），37 ℃孵育20 min，PBS 清洗，加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素孵育20 min；DAB 染色，蘇木素復染，脫水、透明，封片。鼠抗人PTEN 單抗、OTUD3 抗體購自Abcam 公司，SP 試劑盒、DAB顯色液購自福州邁新生物技術開發公司，PBS 代替一抗作陰性對照。

結果判讀：CDC14B 陽性判定為細胞漿內呈現棕黃色顆粒。根據陽性細胞數及染色強度進行半定量評分，于高倍鏡下隨機選取5 個視野進行陽性細胞計數，評分標準：染色程度：無染色（0 分），輕度染色（1 分），中度染色（2 分），強染色（3 分）；陽性細胞數計數：陰性（0 分），≤10%（1 分），11% ～ 50%（2 分），51% ～75%（3 分），＞75%（4分）。兩積分和為0～2 分記為陰性表達，＞2 分記為陽性表達。

1.4 統計學分析 采用SPSS 25.0 進行數據分析處理，計數資料采用n（%）表示，計量資料采用均數±標準差（±s）表示。癌組織及癌旁正常組織中miR-1225-5p 及CDC14B 表達比較采用配對樣本t 檢驗和χ2檢驗；兩者表達與臨床病理特征的關系分析采用t 檢驗和χ2檢驗；K-M 法分析兩者表達與預后的關系。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉鱗癌組織及癌旁正常組織中miR-1225-5p 及CDC14B 相對表達比較 喉鱗癌組織中miR-1225-5p mRNA 相對表達水平顯著低于癌旁正常組織（1.7±0.5 vs 5.9±1.6），差異有統計學意義（t=20.508，P＜0.001）。見圖1A。CDC14B 蛋白陽性主要定位于細胞漿呈棕黃色，代表性圖見圖1B。喉鱗癌組織中CDC14B 蛋白陽性率（76.1% vs 37.3%）高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（χ2=20.550，P＜0.001）。

圖1 miR-1225-5p 及CDC14B 在喉鱗癌組織中的表達

2.2 miR-1225-5p 及CDC14B 表達與喉鱗癌臨床病理特征的關系 見表1。根據免疫組化結果將入組患者分為CDC14B 陽性組（n=51）和陰性組（n=16），經分析miR-1225-5p 及CDC14B 表達與臨床病理特征的關系，結果顯示：miR-1225-5p mRNA 不同表達在喉鱗癌患者分化程度（χ2=3.824，P=0.000）、T 分期（χ2=1.859，P=0.034）、TNM 分期（χ2=3.597，P=0.000）及是否淋巴結轉移（χ2=2.191，P=0.016）之間的差異具有統計學意義。CDC14B 蛋白不同表達在喉鱗癌患者腫瘤直徑（χ2=5.060，P=0.025）、分化程度（χ2=6.125，P=0.013）、T 分期（χ2=10.129，P=0.001）、TNM 分期（χ2=8.114，P=0.014）及是否淋巴結轉移（χ2=4.273，P=0.038）之間的差異具有統計學意義。

表1 miR-1225-5p 及CDC14B 表達與臨床病理特征的關系

2.3 miR-1225-5p 及CDC14B 與喉鱗癌患者預后的關系 見圖2。根據入組患者miR-1225-5p mRNA表達平均數分為miR-1225-5p 高表達組（n=18）和低表達組（n=49）。至末次隨訪結束，所有患者均獲得完整隨訪資料，隨訪時間為4 ～60 個月，失訪6 例，死亡20 例（miR-1225-5p 低表達組死亡18 例，CDC14B 陽性組19 例）。K-M 法繪制生存曲線分析預后總生存率，結果顯示：miR-1225-5p 低表達組術后5年總生存率明顯低于高表達組，差異有統計學意義（Log-rank P=0.046）；CDC14B陽性表達組術后5年總生存率明顯低于陰性表達組，差異有統計學意義（Log-rank P=0.023）。

圖2 miR-1225-5p 及CDC14B 表達與喉鱗癌患者預后的關系

3 討論

近年在對腫瘤分子機制的研究中發現，miRNA參與基因表達的調控，與人類多種腫瘤的發生發展密切相關[9]。研究表明[10]，miRNAs 作為致癌或抑癌基因在人類多種腫瘤發病機制中發揮腫瘤抑制因子、癌基因或腫瘤干細胞調節因子等重要作用。且在miRNA 表達差異的研究中，有文獻綜述了近幾年國內外研究癌癥相關的miRNA 標記物，發現癌癥的發生發展過程伴隨著眾多miRNAs 的異常表達，不同類型惡性腫瘤發生發展的不同階段常伴隨著某些特異性miRNA 分子表達的增高或降低[11-12]。由此可見，miRNAs 參與癌癥發展的各個階段，通過對miRNAs進行探究分析，可為喉癌臨床診治提供幫助。

miR-1225-5p 是近年新發現的一個miRNA，研究發現在胃癌及膠質母細胞瘤中miR-1225-5p 表達抑制，其異常過表達可抑制細胞的增殖、侵襲及遷移，并證實胰島素受體底物1（nIRS1）可能是miR-1225-5p 的功能靶點，其可能通過抑制IRS1 進而發揮抑制作用[4-5]。胰腺癌細胞系中miRNA-1225-5p通過靶向JAK1 抑制胰腺癌細胞凋亡[13]。miRNA-1225-5p 通過介導ROS 生成，激活Keap1-Nrf2-HO-1 信號通路，抑制TNF-TNF -誘導的小鼠破骨細胞形成[14]。miR-1225-5p 差異表達是星形細胞瘤臨床診斷及預測預后的良好標記物[15]。提示miR-1225-5p 可作為新的腫瘤治療靶標及預后標志物。本研究探究發現喉鱗癌組織中miR-1225-5p 表達下降，進一步分析發現其與惡性病理及預后關系密切，表明miR-1225-5p 參與喉鱗癌發生發展進程。

CDC14B 是一種高度保守的雙特異性磷酸酶，在腫瘤的研究中發現[16]，CDC14B 作為重要細胞周期調節因子，能夠幫助DNA 修復損傷，保證基因遺傳穩定性，也可抑制癌基因異常表達，防止細胞惡性病變。CHIESA 等[17]發現，在鼠成纖維細胞系NIH3T3 中CDC14B 過表達可導致細胞發生惡性轉變。WEI 等[18]研究發現，CDC14B 以和癌基因H-RasV12 相似的作用方式發揮致癌作用。神經膠質瘤中，CDC14B 通過調控SKP2/p21/p27 信號通路抑制癌細胞的增殖和分化[19]。腎透明細胞癌組織中CDC14B mRNA 表達水平明顯降低，其低表達患者腫瘤分期和復發風險更高[20]。惡性程度越高、侵襲性越強的不同類型甲狀腺髓樣癌組織中CDC14B 表達水平越低[21]。乳腺癌組織中CDC14B表達水平均較正常組織明顯降低，其低表達患者腫瘤惡性程度越高，預后越差[7]。大量研究已證實[16,18]，CDC14B 涉及腫瘤發生發展的多個方面，具有多種生物學功能，既充當致癌基因，又可充當抑癌基因。而本研究檢測發現，喉鱗癌組織中CDC14B 蛋白隨著喉鱗癌惡性發展明顯增加，提示其在喉鱗癌中可能充當致癌因子。本研究結果提示miR-1225-5p 和CDC14B 與喉鱗癌惡性發展進程及預后關系密切，為喉鱗癌的研究提供了新的思路和目標，但將其作為理想的預后分子標志物仍需納入更多臨床數據進行探討。此外，目前有關miR-1225-5p 和CDC14B在喉鱗癌中的研究報道較少，而本研究僅基于臨床病理初步探究了兩者在喉鱗癌中的表達及作用，其具體調控的作用機制及兩者間的相互作用還尚未知，后期還需通過設計體外實驗于分子細胞生物學角度對兩者參與調控喉鱗癌發生發展的內在分子作用機制進行深入探討，以期為喉鱗癌臨床治療提供新的可靠靶點。

綜上所述，喉鱗癌組織中miR-1225-5p 低表達，CDC14B 陽性表達，與臨床病理及預后關系密切，進一步探究其與喉鱗癌發生發展的分子作用機制，可為喉鱗癌提供新的治療靶點。