新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）熱滅活咽拭子及熱滅活后提取核酸樣本在4℃保存的穩定性研究

喻 晶，吳夏楓，劉曉翌，紀 玲（北京大學深圳醫院檢驗科，廣東深圳 518029）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）自從2019年12月首次在湖北武漢發現以來，短時間內在武漢暴發流行并蔓延至全國，嚴重危害人民的生命健康，影響人們的生活方式，此病毒對人的傳染性強，目前尚無特效治療，最有效的方式是早發現、早隔離，早治療、盡早阻斷傳染源[1]。新冠病毒核酸檢測可以為新型冠狀病毒肺炎的早期診斷提供直接的實驗室證據，也是目前最新診療方案（試行第八版）中COVID-19 的確診依據[2]。由于此病毒傳染性極強，使實驗室檢測人員處于極大的感染風險中，根據第五版新型冠狀病毒肺炎防控方案[3]，該病毒對熱敏感，56℃ 30 min 可有效滅活病毒，本實驗室在核酸檢測前會對樣本進行56℃ 30min 熱滅活處理。目前對熱滅活后的新冠樣本和提取核酸在4℃保存的穩定性，其對檢測結果的影響尚未見報道，樣本保存是保證檢驗質量的重要環節，直接影響檢測的結果，本研究把熱滅活后的樣本及提取的核酸保存在4℃，分別于24, 48, 72 和96h 再次檢測樣本及提取核酸中SARS-CoV-2 核酸的含量（Ct 值），分析熱滅活后樣本和核酸在4℃保存的穩定性，為樣本的合理保存提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2020年2月5日在本院發熱門診就診的1 例SARS-CoV-2 核酸檢測陽性患者的咽拭子樣本，樣本保存在Hanks 液（廣州邦碩生物技術有限公司）。該患者為武漢人，發熱、咳嗽、肺部CT 表現為病毒性肺炎，最終診斷為新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）。

1.2 儀器與試劑 全自動核酸提取儀（Stream SP96，中山大學達安基因股份有限公司），熒光定量PCR 擴增儀（ABI 7500, 美國Thermofisher）。恒溫水浴箱（ED-19，德國JULABO），核酸提取試劑盒及新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒均為中山大學達安基因股份有限公司產品。咽拭子采樣管和保存液為廣州邦碩生物技術有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取：COVID-19 患者咽拭子樣本先采用56℃水浴30min 滅活病毒，振蕩混勻后取200μl樣本加入核酸提取試劑板，按照說明書要求提取樣本的核酸，然后進行檢測。將原始咽拭子樣本和提取的核酸保存在4℃冰箱，保存24, 48, 72 和96h 后再次對其進行SARS-CoV-2 核酸ORF1ab 和N 基因檢測。

1.3.2 基因擴增：采用RT-PCR 熒光定量PCR 技術，檢測新型冠狀病毒ORF1ab 基因 和N 基因，每管為25μl 反應體系，其中PCR 反應液體系20μl，樣本核酸或陰陽對照品5μl，混勻后，按下面程序在熒光PCR 擴增儀中擴增：50℃ 15 min，95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 45 s，共45 個循環，熒光收集在55℃ 45 s。每次擴增時設置空白和陰陽性對照。以循環閾值（cycle threshold，Ct 值）來進行核酸檢測差異的比較。

1.4 統計學分析 采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，采用t 檢驗比較兩組數據的差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 咽拭子樣本4℃保存的穩定性分析 咽拭子樣本檢測結果為ORF1ab 和N 基因雙陽性，Ct 值分別為31.27 和30.64，咽拭子樣本4℃保存24, 48, 72和 96h 后再次檢測ORF1ab 和N 基因，結果見表1。4℃保存24h，咽拭子檢測結果與原始結果差異不大，ORF1ab 和N 基因的ΔCt 分別為0.14 和0.04（偏倚均小于1%），但是4℃保存48, 72 和96h后，ORF1ab 和N 基因的ΔCt 明顯增大，4℃保存48～72h， ORF1ab 基因核酸降解了大概7 倍，N 基因降解了大概11 倍，4℃保存96h, ORF1ab 和N 基因核酸分別降解了30.91 倍和666.29 倍。

表1 咽拭子樣本4℃保存不同時間的檢測結果

2.2 核酸樣本4℃保存的穩定性分析 核酸樣本檢測結果為ORF1ab 和N 基因雙陽性，Ct 值分別為31.27 和30.64，提取的核酸樣本4℃保存24, 48,72 和96h 后再次檢測ORF1ab 和N 基因，結果見表2。核酸4℃保存24, 48, 72h 和96h 后，其檢測結果與原始結果Ct 值差異不大（均在±1 以內,偏倚均小于3%），表明核酸4℃保存24～96h 后,無明顯降解。

表2 提取的核酸4℃保存不同時間的檢測結果

2.3 咽拭子樣本和提取核酸4℃保存不同時間結果比對 采用t 檢驗比較咽拭子和核酸4℃保存0，24，48, 72 和96h 后，ORF1ab 和N 基因檢測 的結果，均具有顯著性差異（tORF1ab=2.023,P=0.039;tN=2.239,P=0.028）。核酸4℃保存24～96h 的穩定性更好。

3 討論

新型冠狀病毒為單鏈RNA 病毒，是一種新型β 屬冠狀病毒，基因特征與SARS-CoV 和MERSCoV 有明顯區別[2]，其傳染性強，人群普遍易感，自2019年12月在武漢發現以來，COVID-19 的病例數快速上升，引起了世界范圍的關注,給全球帶來巨大挑戰[4]。SARS-CoV-2 核酸檢測可以為COIVID-19 的診斷提供確診依據[2]，但是由此病毒在檢測過程中對人體的致病力和危害程度尚未明確，使檢測人員處于極大的感染風險中。根據最新的專家共識[5]，SARS-CoV-2 對熱敏感，56℃ 30 min可有效滅活病毒，實驗室在檢測前對病人樣本進行熱滅活處理，降低檢測中的感染風險。目前對熱滅活后的樣本和提取的核酸樣本在4℃保存的穩定性尚未見報道，本研究主要分析熱滅活后樣本和提取核酸在4℃保存24～96h 后的穩定性，為制定合理的樣本保存溫度和時間提供實驗室依據。

本研究發現保存在hanks 液中的咽拭子樣本，在4℃保存24h,其核酸無明顯降解，但是在4℃保存48～72h 后，其核酸出現明顯降解，其中N 基因降解比ORF 1ab 基因降解更明顯（11～12 倍vs7-8倍），樣本4℃保存96h 后，核酸降解更加明顯，其中ORF 1ab 基因降解30 倍，N 基因降解666 倍，其Ct 值為40.02，處于檢測的臨界值。有趣的是，我們發現提取的核酸樣本4℃保存24～96h 后，核酸無明顯降解，其ΔCt 均在±1 以內，偏倚均小于3%。核酸4℃保存的穩定性明顯比咽拭子樣本好，差異具有統計學意義（P＜0.05）。我們把核酸樣本在4℃保存2 周，再次檢測發現核酸仍然無明顯降解（結果未顯示），SARS-CoV-2 的RNA 為什么會這么穩定？這個問題值得我們進一步探討。有研究表明[6]，COVID-19 非常穩定，可在氣溶膠中和物體表面上保持穩定數小時至數天的時間。

本研究的局限性在于：①受陽性樣本例數的限制，本研究的陽性樣本的例數太少，最好對處于高中低不同Ct 值范圍的陽性樣本進行驗證。②未對保存在不用類型保存液中的咽拭子陽性樣本進行驗證，不同類型的保存液是否存在差異？③本研究只采用了一家公司的試劑，本文的結果是否適合于其他公司的試劑，有待進一步驗證。